A recurrent homozygous mutation affects the BUD13 gene whose residual expression correlates with the severity of a novel human progeroid disorder

Abstract

Human progeroid disorders tend to mimic aspects of physiological ageing seen in humans that include disruption of various cellular functions. Amongst molecular processes, alternative splicing events generating truncated pathogenic variants are previously implicated in progeroid disorders such as Hutchinson-Gilford Progeria syndrome. In eukaryotic spliceosome, correct splicing is ensured by the interplay of splicing factor proteins. The retention and splicing (RES) complex is a heterotrimer involved in splicing processes that prevents nuclear pre-mRNA leakage and is highly conserved from yeast to other higher organisms. However, the function of its components are poorly understood in mammalian development.

In this study, we identified a homozygous nonsense mutation affecting a RES component BUD13 in five individuals diagnosed with a complex progeroid disorder. The disease is characterised by growth restriction, lipoatrophy and early demise in three individuals of an unidentified cause. The C- terminal region of BUD13 is specifically associated with splicing activity. Upon investigation of human adult fibroblasts from patients, the pathogenic variant was observed to induce alternative splicing of the BUD13 pre-mRNA, producing a truncated but stable protein carrying an in-frame deletion at the N-terminal. A lower expression level of the truncated variant correlated with shorter life expectancy of the individuals and also with a higher degree of mitochondrial perturbation, nuclear aberration, impaired proteostasis and early cellular senescence. However, upon whole transcriptome analysis of fibroblasts from affected individuals, very few pre-mRNA or nascent transcripts were found to be misspliced. Modeling of the exact human mutation in mice using CRISPR/Cas9 also caused alternative splicing to produce an in-frame deleted Bud13 variant (Bud13-106del). A second mouse model carrying frame shift mutation at the N-terminus also led to the generation of an alternatively spliced out product (Bud13-113del). The ud13-113del variant interestingly gave rise to viable chimeric mice that eventually displayed some major aspects of the human disease including progressive lipoatrophy and early demise. In both the mouse models, reduced expression of the Bud13 protein caused early embryonic lethality as has also been shown previously for loss-of-function of Bud13 in zebrafish.

Altogether, the N-terminus of BUD13, not present in yeast, truncated by the variant detected in the affected individuals is much less conserved than the C-terminus, suggesting that this part of the protein could have acquired additional functions during evolution. Our findings indicate that the protein and its N-terminus, governing various cellular functions and senescence, are critical candidates for future studies to understand physiological ageing in humans.

Humane progeroide Erkrankungen ahmen Facetten des physiologischen Alterns des Menschen nach und häufig treten dabei Beeinträchtigungen zellulärer Strukturen. Bisher wurden bezüglich zugrundeliegender molekularer Prozesse insbesondere alternative Spleißvorgänge, die verkürzte pathogene Varianten erzeugen, bei progeroiden Störungen wie dem Hutchinson-Gilford-Syndrom in Betracht gezogen. Für ein korrektes Spleißen im eukaryotischen Spleißosom sorgt das Zusammenspiel einer Vielzahl Spleißfaktoren bezeichnet werden. Der Retentions- und Spleißkomplex (RES) ist ein Heterotrimer, welches an Spleißprozessen beteiligt ist und von Hefen bis zu anderen höherentwickelten Organismen hoch konserviert ist. Die Funktion seiner Komponenten sind jedoch bei der Entwicklung von Säugetieren nur unzureichend verstanden. In dieser Studie haben wir bei fünf Personen, bei denen eine komplexe progeroide Störung diagnostiziert wurde, eine homozygote Nonsense-Mutation identifiziert, die eine RES-Komponente BUD13 betrifft. Diese ist gekennzeichnet durch Wachstumseinschränkungen, einer Lipoatrophie und dem frühen Ableben von drei der fünf Individuen. Die C-Terminalvon BUD13 ist von entscheidender Bedeutung für die Spleißaktivität. Bei der Untersuchung der menschlichen, reifen Fibroblasten der Patienten wurde beobachtet, dass die pathogene Variante ein alternatives Spleißen der BUD13-prä-mRNA induziert und ein verkürztes, aber stabiles Protein mit einer in-frame-Deletion am N-Terminus produziert. Ein niedrigeres Expressionsniveau der verkürzten Variante korrelierte mit einer kürzeren Lebenserwartung der Individuen und auch mit einem höheren Grad an mitochondrialen Störungen, nuklearen Aberrationen, gestörter Proteostase und früher zellulärer Seneszenz. Allerdings wurde bei der Analyse des gesamten Transkriptoms der Fibroblasten der Betroffenen festgestellt, dass nur sehr wenige die prä-mRNA oder die naszierenden Transkripte falsch gespleißt wurden. Die Imitation der humanen Mutation mit CRISPR/Cas9 führte auch zu alternativem Spleißen und zwei in-Frame-deletierten Bud13-Varianten (Bud13-106del und Bud13-113del) im Mausmodell. Die Bud13-113del Variante brachte interessanterweise Maus-Chimären, die letztendlich einige wichtige Aspekte der menschlichen Krankheit zeigten, darunter fortschreitende Lipoatrophie. In beiden Mausmodellen verursachte die verminderte Expression des Bud13-Proteins eine frühe embryonale Letalität, wie zuvor auch für den Funktionsverlust von Bud13 bei Zebrafischen gezeigt wurde. Alles in allem, die N-terminale Region von BUD13, die in Hefen nicht vorhanden ist und die von der in den betroffenen Individuen entdeckten Variante verkürzt wird, ist viel weniger konserviert als die C-terminale Region. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Protein und sein N-Terminus, die verschiedene Zellfunktionen und die Seneszenz steuern, entscheidende Kandidaten für zukünftige Studien zum Verständnis des physiologischen Alterns beim Humanen sind.