Strategien zur Nutzung des Potenzials menschlicher Herzvorläuferzellen für die Herzzelltherapie

Abstract

Ischaemic heart disease is the most common cause of death worldwide. Yet, standard procedures to treat myocardial damage still heavily depend on the availability of heart transplants. Cardiac cell therapy has arisen as a prospective strategy to halt the progression and potentially revert heart failure. Cardiac progenitor-like cells, such as stem cell antigen-1 (Sca-1) positive cells, are an attractive cell population as they proliferate and represent a source of cardiac cells. These Sca-1 positive progenitors, also known as human cardiomyocyte progenitor cells (hCMPCs), have been isolated from fetal and adult human hearts. However, despite promising preclinical data, clinical application of hCMPCs relies on heart tissue availability or is bound to carry patient associated comorbidities, which can ultimately influence the cells’ therapeutic potential. In addition, as a result of hCMPCs multipotent nature, another challenge is to predict cell fate upon transplantation into the myocardium. This thesis aims to address these issues. Genetically reprogrammed embryonic-like stem cells namely human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) could represent a readily available unlimited source of hCMPCs. In this study, Sca-1 positive cells isolated from hiPSCs undergoing cardiomyocyte differentiation (iCPCSca-1) were highly proliferative and resembled fetal hCMPCs as assessed by expression of CD105, and absence of CD34 and CD45 expression. Also, 84% of iCPCsSca-1 were cardiac troponin I positive and 15% expressed NKX 2-5, both markers associated to the cardiac lineage. Morphological changes and increased α- actinin expression when cultured in differentiation medium suggested that iCPCsSca-1 might hold cardiomyogenic potential. Next, a conditional gene expression system was combined with state-of-the-art RNA interference (RNAi) technology to modulate the Wnt signaling pathway, which governs differentiation of cardiac progenitors into cardiomyocytes. Founding experiments in a HeLa reporter cell line suggested that homogeneous and robust induction of RNAi expression can be achieved by inserting gene regulatory elements in different genomic loci. In this configuration, silencing β- catenin, a Wnt key mediator, led to 85% β-catenin knockdown in hiPSCs harboring a single copy of RNAi. Moreover, silencing β-catenin in hiPSC-derived mesoderm cells for 4 days led to nearly 3-fold cardiac troponin T positive cells at day 11 of differentiation as compared with untreated cells. Although the lower differentiation efficiency of cells harboring the RNAi targeting β-catenin remains to be investigated, conditional β-catenin silencing may be a promising strategy to increase the conversion rate of mesoderm cells into cardiomyocytes.

Ischämische Herzkrankheiten sind weltweit die häufigste Todesursache und Standardverfahren zur Behandlung von Myokardschäden hängen stark von der Verfügbarkeit von Herztransplantaten ab. Die Herzzelltherapie hat sich als eine vielversprechende Strategie erwiesen, um das Fortschreiten von Herzschäden zu stoppen und möglicherweise die Herzinsuffizienz umzukehren. Herzvorläufer-ähnliche Zellen, wie Stammzell-Antigen-1 (Sca-1)-positive Zellen, stellen hierfür eine attraktive Zellpopulation dar, da sie sich vermehren und in Herzzellen differenzieren. Diese Sca-1- positiven Zellen, auch als humane Kardiomyozyten-Vorläuferzellen (hCMPCs) bekannt, können aus fötalen und erwachsenen menschlichen Herzen isoliert werden. Trotz vielversprechender präklinischer Daten hängt die klinische Anwendung von hCMPCs von der Verfügbarkeit von Herzgewebe ab und ist mit patientenassoziierten Komorbiditäten verbunden, die letztendlich das therapeutische Potenzial der Zellen beeinflussen können. Aufgrund der multipotenten Natur von hCMPCs besteht eine weitere Herausforderung darin, das Schicksal dieser Zellen vorherzusagen, wenn sie in das Myokard transplantiert werden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand daher darin, diese Sca-1-positiven Zellen näher zu untersuchen. In dieser Arbeit wurden Sca-1-positive Zellen aus induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) isoliert und einer Kardiomyozyten-Differenzierung unterzogen. Sie waren hochproliferativ, exprimierten CD105 und ähnelten fötalen hCMPCs. Eine Expression von CD34 und CD45, zwei Marker für endotheliale Vorläuferzellen, wurde nicht nachgewiesen. Im Gegensatz dazu waren 84% der isolierten iCPCSca-1s positiv für kardiales Troponin I und 15% der Zellen exprimierten NKX 2-5, zwei Marker, die mit der kardialen Linie assoziiert sind. Morphologische Veränderungen und eine erhöhte α- Aktinin-Expression während der Kultivierung in Differenzierungsmedium deuteten zudem darauf hin, dass iCPCSca-1s möglicherweise ein kardiomyogenes Potenzial besitzen. Um den Wnt-Signalweg zu modulieren, welcher die Differenzierung von Herzvorläuferzellen in Kardiomyozyten steuert, wurde ein konditionelles Genexpressionssystem mit der RNAInterferenz (RNAi)-Technologie kombiniert. Experimente in einer HeLa-Reporterzelllinie zeigten, dass eine homogene und robuste Induktion der RNAi-Expression durch die Insertion von Genregulationselementen in verschiedene Genomloci erreicht wird. In dieser Konfiguration resultierte die Stummschaltung von β-Catenin, einem wichtigen Wnt- Mediator, in einem 85%igen β-Catenin-Knockdown in hiPSCs. Zudem führte die Stummschaltung von β-Catenin in von hiPSC-abgeleiteten Mesodermzellen für 4 Tage zu einer annähernden Verdreifachung der Anzahl von kardialen Troponin T-positiven Zellen am Tag 11 der Differenzierung im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Daher kann die Stummschaltung von β-Catenin eine vielversprechende Strategie zur Erhöhung der Umwandlungsrate von Mesodermzellen in Kardiomyozyten sein.