Pluripotent stem cells (PSCs) have the ability to undergo indefinite self-renewal while giving rise to the three germ layers. This remarkable capacity has turned PSCs to be a fundamental cell source for regenerative medicine research and applications. The derivation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) over a decade ago has sparked a widespread enthusiasm and opportunity for personalized autologous cell-based therapies in a wide array of diseases. However, the development of optimized disease models and iPSC-derived products heavily relies on the generation of homogenous culture systems for the cell type of interest, which currently presents one of the major hindrances towards the use of PSC derivatives in therapeutic applications. The cerebral cortex is an excellent example of a tissue with enormous heterogeneity that introduces immense challenges for in vitro disease models and therapeutic applications. Our lab mainly focuses on studying the development of the cerebral cortex, particularly investigating the development of cortical neural stem cells (NSCs). Our goal is to devise approaches for the differentiation of PSCs into founder NSC building blocks. We put particular emphasis on achieving high purity that will enable studying authentic cell fate decisions that are associated with regional patterning, self-renewal and differentiation processes that shape the cortex. A homogeneous early cortical population will also enable extracting a more reliable molecular identity of those cells, which can then be used for meaningful disease modeling and for devising sophisticated approaches to induce or maintain self-renewal of such populations in vitro. However, recent research from our lab has shown that current methods to derive early cortical progenitors from PSCs are highly diverse and yield heterogeneous populations containing both cortical and non-cortical cell types. This results in heterogeneous founder NSC populations, limiting their use as a universal pure NSC source. To overcome this hurdle, our lab established a streamlined method known as Triple-i paradigm to derive homogenous starting cortical progenitors both in neural rosettes (2D) and in organoids (3D) platforms. The main objectives of this thesis are to identify early signals that modulate temporal and regional fates within developing founder cortical NSC populations, focusing on small non-coding RNA (miRNAs), which are known to be key regulators of many developmental processes including stem cell proliferation and lineage specifications. These miRNAs guide the early development in a spatiotemporal manner by regulating the expression of multiple gene networks at the post-transcriptional level. They are abundantly expressed in the developing neural tube that eventually gives rise to different regions of central nervous system, including the cerebral cortex. However, it is unknown whether they have the capacity to specify a particular brain region in the cortex such as archicortex that consists of cortical hem, hippocampus and choroid plexus. In this study, we have identified a miRNA important for the specification of archicortex and interrogated its role in cell fate specification using a battery of molecular and cellular studies. First, we employed in vitro human embryonic stem cell-based models (2D monolayer and 3D cerebral organoid) for the derivation of founder neural stem cell and their progression. We then identified a list of miRNAs that are specifically expressed in this early neural stem cell stage, among which we found hsa-miR-20b-5p to be one of the highly expressed microRNAs in early NSCs derived under both monolayer culture and cerebral organoids. Second, by overexpressing hsa-miR-20b-5p in cerebral organoids, we provided evidence that this miRNA is involved in the stepwise specification of choroid plexus of archicortex, by caudalizing the early cortical NSC, due to modulation of WNT and BMP signalling components. In addition, cellular immunostainings displayed a characteristic presence of giant but thin single- layer vesicles positive for choroid plexus markers in miR-20b overexpressing organoids, as opposed to pseudostratified cortical neural rosettes in wildtype organoids. Furthermore, we showed that co-overexpression of miR-20b with of its main target CCND1, lead to the generation of cortical hem/hippocampus organoids. Altogether, through an extensive miRNA-sequencing, single cell RNA-sequencing and cellular immunofluorescence studies, we revealed the expression of hsa-miR-20b-5p in early neural stem cells, its role in the specification of the archicortex lineages and its part as a cell fate modulator for converting cortical organoids towards choroid plexus structures.
Pluripotente Stammzellen (PSCs) haben die Fähigkeit, sich auf unbestimmte Zeit selbst zu erneuern und dabei die drei Keimblätter hervorzubringen. Diese bemerkenswerte Fähigkeit hat PSCs zu einer grundlegenden Zellquelle für die Forschung und Anwendungen der regenerativen Medizin gemacht. Die Gewinnung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) vor über einem Jahrzehnt hat eine weit verbreitete Begeisterung geweckt und Möglichkeiten für personalisierte autologe zellbasierte Therapien bei einer Vielzahl von Krankheiten aufgedeckt. Die Entwicklung optimierter Krankheitsmodelle und von iPSC abgeleiteter Produkte hängt jedoch stark von der Erzeugung homogener Kultursysteme für den bestimmten Zelltyp ab, was derzeit eines der Haupthindernisse für den Einsatz von PSC-Derivaten in therapeutischen Anwendungen darstellt. Die Großhirnrinde ist ein hervorragendes Beispiel für ein Gewebe mit enormer Heterogenität, das für In-vitro-Krankheitsmodelle und therapeutische Anwendungen immense Herausforderungen mit sich bringt. Unser Labor konzentriert sich hauptsächlich auf die Untersuchung der Entwicklung der Großhirnrinde, insbesondere der Entwicklung von kortikalen neuralen Stammzellen (NSCs). Unser Ziel ist es, Ansätze zur Differenzierung von PSCs in Gründer-NSC-Bausteine zu entwickeln. Wir legen besonderen Wert darauf, eine hohe Reinheit zu erreichen, die es ermöglicht, authentische Entscheidungen über das Zellschicksal zu untersuchen, die mit den regionalen Mustern, Selbsterneuerung und Differenzierungsprozessen verbunden sind, die den Kortex formen. Eine homogene frühe kortikale Population wird es auch ermöglichen, eine zuverlässigere molekulare Identität dieser Zellen zu bestimmen, die dann für aussagekräftige Krankheitsmodelle und für die Entwicklung fortgeschrittener Ansätze zur Induktion oder Aufrechterhaltung der Selbsterneuerung solcher Populationen in vitro verwendet werden kann. Jüngste Forschungen aus unserem Labor haben jedoch gezeigt, dass aktuelle Methoden zur Ableitung früher kortikaler Vorläufer aus PSCs sehr vielfältig sind und heterogene Populationen ergeben, die sowohl kortikale als auch nicht-kortikale Zelltypen enthalten. Dies führt zu heterogenen Gründer-NSC-Populationen, die nur beschränkt als universelle reine NSC-Quelle dienen können. Um diese Hürde zu überwinden, hat unser Labor eine optimierte Methode namens Triple-i-Paradigma entwickelt, um homogene kortikale Ausgangsvorläufer sowohl in neuronalen Rosetten (2D) als auch in Organoiden (3D) abzuleiten. Die Hauptziele dieser Arbeit sind die Identifizierung von frühen Signalen, die zeitliche und regionale Schicksale innerhalb sich entwickelnder kortikaler NSC-Populationen modulieren. Dabei liegt der Fokus auf kleinen nicht-kodierenden RNAs (miRNAs), die wichtige Regulatoren vieler Entwicklungsprozesse sind, wie Stammzellproliferation und Zelltyp-Spezifizierung. Diese miRNAs steuern die frühe Entwicklung in Raum und Zeit, indem sie die Expression mehrerer Gennetzwerke auf posttranskriptioneller Ebene regulieren. Sie werden reichlich im sich entwickelnden Neuralrohr exprimiert, aus dem schließlich verschiedene Regionen des zentralen Nervensystems, einschließlich der Großhirnrinde, hervorgehen. Es ist jedoch nicht bekannt, ob sie in der Lage sind, eine bestimmte Hirnregion im Kortex zu spezifizieren, wie z.B. den Archicortex, der aus kortikalem Saum, Hippocampus und Plexus choroideus besteht. In dieser Studie haben wir eine miRNA identifiziert, die für die Spezifikation des Archicortex wichtig ist, und ihre Rolle bei der Spezifikation des Zellschicksals mit einer Reihe von molekularen und zellulären Studien untersucht. Zunächst verwendeten wir in vitro-Modelle auf der Basis von humanen embryonalen Stammzellen (2D-Monolayer und 3D-zerebrales Organoid) zur Ableitung von neuralen Gründerstammzellen und deren Progression. Wir identifizierten eine Reihe miRNAs, die spezifisch in diesem frühen neuralen Stammzellstadium exprimiert werden. Unter anderem identifizierten wir hsa-miR-20b-5p als eine der hochexprimierten miRNAs in frühen NSCs, die entweder aus Monolayer-Kulturen oder zerebralen Organoiden stammen. Zweitens lieferten wir durch die Überexpression von hsa-miR-20b-5p in zerebralen Organoiden den Nachweis, dass diese miRNA an der schrittweisen Spezifizierung des Plexus choroideus des Archicortex beteiligt ist, indem sie die frühen kortikalen NSC durch die Modulation von WNT- und BMP-Signalkomponenten kaudalisiert. Darüber hinaus zeigten zelluläre Immunfärbungen ein charakteristisches Vorhandensein von riesigen, aber dünnen einschichtigen Vesikeln, die – im Gegensatz zu pseudostratifizierten kortikalen neuralen Rosetten in Wildtyp-Organoiden – positiv für Plexus choroideus-Marker in miR-20b-überexprimierenden Organoiden waren. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die Ko-Überexpression von miR-20b mit seinem Hauptziel CCND1 zur Bildung von kortikalen Hem-/Hippocampus-Organoiden führt. Insgesamt haben wir durch umfangreiche miRNA-Sequenzierung, Einzelzell-RNA-Sequenzierung und zelluläre Immunfluoreszenzstudien die Expression von hsa-miR-20b-5p in frühen neuralen Stammzellen, seine Rolle bei der Spezifizierung der Archicortex-Linien und seine Rolle als Zellschicksalsmodulator zur Umwandlung von kortikalen Organoiden in Strukturen des Plexus choroideus aufgedeckt.
