This thesis describes experiments to evolve a mesophilic bacterium, Escherichia coli, towards halophily. The applied technology consisted in the continuous proliferation of vast populations of cells in suspension in the "Genemat" format under self-adjusting, limiting NaCl concentrations in the growth medium. This was achieved by applying a conditional pulse feed regime where the proliferating suspension culture is periodically diluted with a "permissive" medium of an osmolarity that is compatible with growth of the cells if cell density falls below a pre-set value, and with a pulse of "nonpermissive" medium of high osmolarity when cell density is superior to this threshold. This regime favors genetic variants with elevated osmotolerance, which rapidly replace their less-adapted progenitors. Two parallel cultures were run over approximately 8800 and 6700 generations, respectively. The first culture consisted of the prototypic E. coli strain MG1655, the second of a Δdef/fmt/mutD variant (ε2124) which is distinct from other eubacteria in its mechanism of initiation of translation and, in addition, shows a mutator phenotype. Both experiments yielded offspring with greatly enhanced levels of halotolerance, MG1655 evolvants growing at steady state concentrations of 1.3 M NaCl with generation times of about 4 hours, ε2124 evolvants supporting steady state concentrations of about 1.2 M NaCl. The former can grow in salinities of up to 2.0 M, the latter up to 1.6 M. They tolerate similar concentrations of KCl and K2SO4, as well as the uncharged, osmotically active sugar, sorbitol. Evolved derivatives are impaired in growth at low salinities but can still be adapted to grow in the absence of extracellular salt. Whereas adaptation proceeded smoothly for MG1655 cells, the ε2124 culture showed massive and sustained oscillations in the consumption of nonpermissive medium, an effect that could be due to its high genetic variability. Whereas both populations of evolving cells relied on synthesis of the disaccharide trehalose as an intracellular osmoprotectant during the initial stages of the experiments, both cultures switched later this strategy to massive accumulation of the amino acid proline which can accumulated to intracellular concentrations of up to 500 mM during growth in high salt medium. Both derivatives may chronically enrich K+ ions in their cytosol since both showed enhanced sensitivity for the presence of KI, and MG1655 derivatives could not grow at salt concentrations of more than 1 M NaCl when K+ was omitted from the growth medium. The general stress response of evolved cells was compared with that of wild type MG1655 cells by analyzing the expression of the stress sigma factor, RpoS, on Western Blots of cellular proteins isolated during growth at various salt concentrations. From these analyses it can be concluded that the stress answer sets in at higher salinities in the evolved derivatives. Changes in the outer membrane and total proteomes were revealed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and two- dimensional gel electrophoresis. Further work should aim in doing analysis of the adaptive changes during the evolution process in molecular details by determination of the complete genome sequences as well as further functional, physiological, transcriptomic, and proteomic analysis, and both experiments should be continued.
Diese Arbeit beschreibt Experimente zur Evolution des mesophilen Bakteriums Escherichia coli zur Halophilie. Dazu wurde die Technologie der kontinuierlichen Kultur großer Populationen von Zellen in Suspension unter automatisch eingestellten, gerade noch mit dem Wachstum der bestangepassten Varianten vereinbaren Salzkonzentrationen im "Genemat"-Format angewendet. Die Zellen wurden in einem conditional pulse feed Regime kultiviert. Dabei wird das Kulturgefäß mit Pulsen eines "permissiven" Mediums (mit einer Salzkonzentration, die mit dem Wachstum der Zellen vereinbar ist) verdünnt, wenn die Zelldichte unter einer vorgegebenen Schwelle liegt. Übersteigt die Zelldichte diese Schwelle, so wird stattdessen mit einem Puls von "nichtpermissivem" Medium (mit wachstumslimitierender Salzkonzentration) verdünnt. Unter diesen Bedingungen genießen genetische Varianten mit erhöhter Salztoleranz einen selektiven Vorteil gegenüber ihren weniger salztoleranten Vorläufern und verdrängen diese rasch aus der Kultur. Es wurden zwei parallele Experimente über etwa 8800 Generationen und etwa 6700 Generationen durchgeführt. Für das erste Experiment wurde der prototypische E. coli Stamm MG1655 eingesetzt, für das zweite ein Abkömmling davon, ε2124, der sich durch eine Deletion des def/fmt Operons auszeichnet und sich daher im Mechanismus der Initiation der Proteinsynthese von anderen Eubakterien unterscheidet und der zudem auf Grund einer Mutation des mutD Gens einen Mutatorphänotyp zeigt. Beide Experimente resultierten in der Selektion von Evolvaten, die gegenüber dem Ausgangstyp stark erhöhte Salzresistenz aufweisen, wobei MG1655 Derivate mit Generationszeiten von etwa 4 Stunden kontinuierlich bei 1,3 M NaCl wachsen können, ε2124 Derivate bei etwa 1,2 M NaCl. MG1655 Derivate zeigen Wachstum noch bei 2 M NaCl, ε2124 Derivate bis etwa 1,6 M. Ähnliche Konzentrationen anderer Salze wie KCl und K2SO4 werden ebenso toleriert wie hohe Konzentrationen des Zuckers Sorbitol. Die evolvierten Derivate wachsen schlecht in Abwesenheit von Salz, können aber noch an Medien mit geringen Salzkonzentrationen adaptieren. Während die Adaptation im Fall von MG1655 recht gleichmäßig voranschritt, zeigte die ε2124 Kultur starke, anhaltende Schwankungen im Verbrauch an nichtpermissivem Medium. Dies könnte im Mutator- Phänotyp dieser Linie begründet sein. Während früher Stadien der Evolutionsexperimente akkumulierten Zellen beider Linien intrazellulär das Disaccharid Trehalose als osmoprotektive Substanz. Beide Linien wechselten dann auf die massive intrazelluläre Akkumulation der osmoprotektiven Aminosäure Prolin, die in den Zellen bei hoher externer Salinität Konzentrationen von bis zu 500 mM erreichen konnte. Eine erhöhte Sensitivität gegenüber dem toxischen KI und eine starke Verringerung der Salztoleranz in Abwesenheit von Kalium im Medium könnten darauf hinweisen, dass die evolvierten Derivate intrazellulär Kaliumionen anreichern. Die Stressantwort evolvierter Zellen wurde mit der von Wildtyp Zellen anhand der Expression des "Stress-Sigmafaktors" RpoS während des Wachstums in unterschiedlichen Salinitäten verglichen. Aus den erhaltenen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass die Stressantwort in den evolvierten Stämmen bei höherer externer Salzkonzentration induziert wird als im Wildtyp. Analysen der Proteinzusammensetzung von Präparationen der äußeren Membran und von Gesamt- Zellextrakten durch 1- und 2-dimensionale Gelektrophoresen zeigen Änderungen im Proteom. Neben der Fortsetzung der Evolutionsexperimente sollten in künftigen Arbeiten molekulare Details des Adaptationsprozesses anhand von Gesamtsequenzen der evolvierten Genome ermittelt werden, und weitere funktionelle und physiologische Studien sowie Transkriptom- und Proteomanalysen sollten durchgeführt werden, um Ablauf und Resultat der Evolution zu beschreiben.