Serodiagnosis of glanders with reference to endemic and non-endemic settings

Abstract

Glanders is a highly infectious and zoonotic disease of solipeds caused by Burkholderia mallei. Progressive loss of efficiency and fatal outcome resulted in massive economic losses which forced veterinary authorities throughout the world to implement disease control measures; these included mass testing using the complement fixation test and/or malleinisation, and the culling of positives. This led to the eradication of glanders from Western Europe and North America in the 1950s. However, in the last decade, the number of outbreaks in Asia and South America increased steadily and glanders regained the status of a re-emerging transboundary disease. Pakistan has been an endemic country for the past 120 years but concise data on the presence of disease are not available. A total of 533 serum samples were collected from draught equines, a suspected risk group for glanders, from various districts of the Pakistani Punjab. The complement fixation test (CFT) and the highly sensitive Western blot technique were used for serodiagnosis. No positive animal (horse, mule, and donkey) was found. Glanders seems to be restricted to remote, sporadic pockets of endemicity and may cause outbreaks after being introduced into naive populations by (asymptomatic) shedders. Various serological tests were used for the diagnosis of glanders in the past but still complement fixation test (CFT) is the internationally prescribed test for trading equines. A new immunoblot (IB) technique has recently been introduced to overcome the well known shortcomings of CFT i. e. a considerable number of false positive and negative results and anticomplementary effect of sera. The objective of this study was the comparative evaluation of two glanders CFT antigens commercially available at Central Veterinary Institute of Wageningen UR, Lelystad, The Netherland (CIDC) and at c.c.pro GmbH, Oberdorla, Germany (c.c.pro) in an glanders endemic area regarding specificity and sensitivity. A total of 1,678 serum samples from the endemic region (Province Punjab, Pakistan) and a non-endemic area (Germany) were analysed. All sera tested positive or suspicious with CFT were analysed by the confirmatory IB to exclude CFT false positive results. Both CFT antigens showed 100% sensitivity. The use of CIDC or c.c.pro antigen resulted in specificities of 77.45% or 75.71% for sera from endemic area and 93.75% or 94.79% for sera from non-endemic areas, respectively. The results demonstrate the different performances of identical tests in different epidemiologically settings. Based on these results, the combined use of CFT and IB is highly suggestive for the serodiagnosis of glanders. Good agreement was calculated between CFT (using either c.c.pro or CIDC antigen) and IB. In response to third objective of comparatively evaluation of three commercially available antigens: (c. c. pro, CIDC and USDA) using sera from glanders free (Germany) and glanderous/immunised animals, the sensitivity and specificity of three commercially available complement fixation test (CFT) antigens from c.c.pro (c.c.pro), Central Veterinary Institute of Wageningen UR (CIDC) and the United States Department of Agriculture (USDA) were comparatively evaluated by testing 410 sera collected from glanders-endemic and non-endemic areas (200 true negative randomly collected sera and 210 sera collected from experimentally immunised animals (12 rabbits, 19 horses), clinical-positive (135) and culture-positive (44) horses, donkeys and mules). Immunoblotting (IB) was used as gold standard test. Highest sensitivity was shown for the CIDC antigen (100%) followed by the c.c.pro antigen (99.39%). However, the USDA antigen showed substantially less (P<0.05) sensitivity (62.19%). Highest specificity was found for the USDA antigen (100%) followed by the CIDC (97.5%) and c.c.pro antigen (96.5%). Positive and negative predictive values for each antigen were calculated to be: 95.88 and 99.48 (c.c.pro), 97.04 and 100 (CIDC), 100 and 76.33% (USDA). Almost perfect agreement (0.96) was found between CFT using either c.c.pro or CIDC and IB. Due to almost perfect agreement (0.96), CFT using c.c.pro or CIDC antigen can be combined with IB to increase the detection rate of glanders among infected animals.

Rotz ist eine anzeigepflichtige, hochkontagiöse Infektionskrankheit der Einhufer und wird durch das Gram-negative, unbewegliche Bakterium Burkholderia (B.) mallei verursacht. Der Ausbruch und die Anzeige der Erkrankung führen durch Handelssperren zu erheblichen ökonomischen Verlusten für die betroffenen Länder. Deshalb forcieren die Veterinärbehörden weltweit Überwachungsuntersuchungen mittels Komplementbindungsreaktion (KBR) und Malleintest. Durch eine strikt durchgeführte Ausmerzung positiver Tiere, konnte Rotz in Westeuropa und Nordamerika in den 50iger Jahren ausgerottet werden. Durch eine steigende Anzahl von Rotzerkrankungen in den letzten 10 Jahren in Südamerika und in Asien wird Rotz jedoch als „re-emerging“ Tierseuche eingestuft. Für die serologische Diagnostik von Rotz sind verschiedene Testverfahren beschrieben. Die KBR ist jedoch die für internationale Handelsuntersuchungen vorgeschriebene Methode. In der Diagnostik mit der KBR bereiten insbesondere falsch positive Ergebnisse oder Proben mit antikomplementären Eigenschaften immer wieder Probleme. Deshalb kam in der vorliegenden Arbeit zusätzlich zur KBR ein Immunoblot-Verfahren (IB) zur Anwendung. Pakistan gilt seit 120 Jahren als endemisch für Rotz. Präzise Daten über die gegenwärtige Situation sind jedoch nicht verfügbar. Deshalb wurden in einer vorläufigen Prävalenzstudie 533 Serumproben von Zugtieren (Pferde, Esel, Maultiere), einer potentiell verdächtigen Risikogruppe, in verschiedenen Bezirken der Provinz Punjab in Pakistan gesammelt und mit der KBR und einem hochsensitiven IB untersucht. Es wurden keine positiven Tiere nachgewiesen. Es kann geschlussfolgert werden, dass Rotz scheinbar nur in begrenzten, weiter abgelegenen Gebieten vorkommt und durch asymptomatische Ausscheider nur sporadisch in erregerfreie Populationen eingebracht wird. In einer weiteren Studie der vorliegenden Arbeit kamen ebenfalls die KBR und der IB zur Anwendung wobei insbesondere die Nutzung verschiedener diagnostischer KBR-Antigene unter Beachtung verschiedener endemischer Situationen bewertet wurde. Gegenstand dieser Studie war die vergleichende Evaluierung zweier Rotz- KBR-Antigene, kommerziell erhältlich bei Central Veterinary Institute in Wageningen UR, Lelystad, Niederlande (CIDC) und c.c.pro GmbH, Oberdorla, Deutschland (c.c.pro) hinsichtlich ihrer Spezifität und Sensitivität in einer Rotz-endemischen Region Pakistans. Insgesamt wurden 1678 Serumproben (davon 25 positive Proben von Tieren bei denen die Infektion durch die Isolierung des Erregers bestätigt wurde) aus der Provinz Punjab (Pakistan) und einer nicht endemischen Region (Deutschland) getestet. Alle KBR-positiven und -verdächtig reagierenden Proben wurden mittels IB untersucht, um falsch positive KBR- Ergebnisse auszuschließen. Beide KBR-Antigene zeigten eine Sensitivität von 100%. Die KBR unter Einsatz des CIDC- oder c.c.cpro-Antigens zeigte Spezifitäten von 77,45% und 93,75% oder 75,71% und 94,79% bei Anwendung auf Proben aus der endemischen oder nicht-endemischen Region. Die Ergebnisse zeigen, dass die Spezifität identischer serologischer diagnostischerverfahren, angewendet in Regionen mit unterschiedlicher epidemiologischer Lage erheblich schwanken kann. Für eine dritte Studie wurden drei kommerziell erhältliche KBR-Antigene zur Rotzdiagnostik, das c.c.pro- und CIDC-KBR-Antigen und das KBR-Antigen des United States Department of Agriculture (USDA), vergleichend eingesetzt. Das c.c.pro-Antigen und CIDC-Antigen bestehen aus einer Mischung dreier B. mallei Isolaten (Bogor, Zagreb und Mukteswar), wohingegen das USDA- Antigen aus nur einem B. mallei Isolat (Chinese) hergestellt wurde. Insgesamt wurden 410 Seren, gesammelt von 200 Pferden aus Deutschland (Gruppe I, negativ) und 210 Serumproben (Gruppe 2, positiv) getestet. Die Seren der Gruppe I galten als negativ, weil Rotz in Deutschland seit mehr als 50 Jahren ausgerottet ist. Die positive Gruppe II setzt sich zusammen aus 44 Tieren aus Pakistan, bei denen die Infektion durch die Isolierung des Erregers bestätigt wurde, aus 135 klinisch krank beurteilten Tieren aus Pakistan und Brasilien, 12 Seren stammten von einem immunisierten Kaninchen und 19 Seren von einem immunisierten Pferd. Die Durchführung der KBR erfolgte gemäß den Vorgaben des OIE - “Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals” unter Nutzung des kommerziell verfügbaren Komplement- und hämolytischen Systems der Firma Virion/Serion. Das c.c.pro- und CIDC-Antigen wurde mit dem Serum für 18h bei 4°C (Kältebindung) und das USDA-Antigen für 1h bei 37°C (Wärmebindung) inkubiert. Alle Proben wurden auch im IB analysiert. Die höchste Sensitivität erreichte das CIDC-Antigen (100%) gefolgt durch das c.c.pro-Antigen (99,39%). Das USDA-Antigen zeigte eine deutlich geringere (P<0,05) Sensitivität (62,19%). Die höchste Spezifität konnte mit dem USDA-Antigen (100%) erzielt werden, gefolgt vom CIDC-Antigen (97,50%) und c.c.pro-Antigen (96,50%). Dabei zeigten die KBR mit dem c.c.pro- oder CIDC-Antigen zusammen mit dem IB die höchste Übereinstimmung (0,96). Ausgehend von diesen Ergebnissen wird für die serologische Diagnostik von Rotz die Kombination aus KBR mit dem c.c.pro- oder CIDC-Antigen und dem IB empfohlen.