Identifizierung Neuronaler und Glialer Autoantigene bei Patienten mit Autoimmunen Enzephalitiden

Abstract

Introduction: In 2007 NMDA-Receptor-Encephalitis was identified as a novel neuro-immunological disease. In this disease autoantibodies bind to an extracellular neuronal antigen (NMDA-receptors) which results in a broad range of symptoms, such as seizures, hallucinations and coma. Since then, other extracellular targets of autoantibodies have been identified, including AMPA- and GABA-receptors. The diseases associated with these autoantibodies are summarized as „Antibody-mediated Encephalitides“. Surprisingly, B-lymphocytes frequently are present in the cerebrospinal fluid of patients with NMDA-Receptor-Encephalitis, producing monoclonal antibodies that target additional neuronal and glial antigens. Furthermore, often patients present with symptoms characteristic for autoimmune encephalitis in the clinic, but with standard diagnostics the corresponding antigen of the autoantibodies cannot be identified. The aim of this study was to develop a protocol that identifies the targets of monoclonal antibodies from cerebrospinal fluid, and also allows one to identify the antigen of native autoantibodies obtained from serum of patients with suspected Antibody-mediated Encephalitis with unknown antigen.

Methods: This study focused on three different antibodies – two monoclonal antibodies, obtained from isolated B-cells from cerebrospinal fluid of patients with NMDA-Receptor-Encephalitis, and native IgA-autoantibodies from serum of a patient with Multiple Sclerosis. First, immunohistochemistry was performed on brain sections in order to confirm reactivity of the autoantibodies within central nervous tissue. In subsequent steps, the specific targets of the autoantibodies were identified, using immunoprecipitation, gel electrophoresis, western blot, staining of transfected HEK-cells and mass spectrometry.

Results: With this protocol, GFAP was recognized as the target of the two monoclonal antibodies. Additionally, the target of the IgA-autoantibodies from serum proved to be native MBP, not the protein in its denatured structure.

Conclusion: With regard to previous studies, it is apparent that autoantibodies against GFAP are not rare and that GFAP-autoantibodies are likely to be associated with specific symptoms and complications. GFAP should thus be included in the standard diagnostic panel of antibody-mediated encephalitides. The autoantibodies, directed against native MBP, show that it is relevant to also screen for autoantibodies directed against proteins in their native structure. The symptoms of the patient stabilized after immunosuppressive therapy, making a pathogenic impact of the autoantibodies likely. With respect to Multiple Sclerosis, given that previous studies focused exclusively on autoantibodies against denatured myelin associated proteins and yielded inconclusive results, it will be necessary in the future to screen against larger patient cohorts for autoantibodies and include natively folded proteins.

Einleitung: Im Jahr 2007 wurde das Spektrum der bekannten neuroimmunologischen Erkrankungen um eine weitere Krankheitsentität erweitert – die NMDA-Rezeptor-Enzephalitis. Hierbei binden Autoantikörper an ein extrazelluläres, neuronales Antigen (NMDA-Rezeptoren) und führen zu mannigfaltigen Symptomen, wie Somnolenz, Krampfanfällen und Halluzinationen. Inzwischen wurden noch weitere extrazelluläre Zielantigene identifiziert, darunter AMPA-und GABARezeptoren. Die damit assoziierten Erkrankungen werden übergreifend als „Antikörpervermittelte Enzephalitiden“ bezeichnet. Überraschenderweise wurde festgestellt, dass bei Patientinnen mit NMDA-Rezeptor-Enzephalitis häufig B-Lymphozyten im Liquor vorliegen, die monoklonale Antikörper gegen zusätzliche Hirnstrukturen bilden. Gleichzeitig kommt es im klinischen Alltag noch häufig vor, dass die Symptomatik eines Patienten für eine autoimmune Enzephalitis spricht, mit der Standarddiagnostik jedoch nicht das betreffende Antigen der vorliegenden Autoantikörper erfasst werden kann. Ziel dieser Studie war es, ein zuverlässiges Protokoll zu entwickeln, das zum einen die Identifizierung der Zielantigene von monoklonalen Antikörpern aus Liquor erlaubt und zum anderen die Identifizierung des Zielantigens von nativen Autoantikörpern aus Serum von Patienten mit Verdacht auf autoimmune Enzephalitis und unbekanntem Zielantigen vereinfacht. Methodik: Es wurde repräsentativ mit drei unterschiedlichen Antikörpern gearbeitet – zwei monoklonale Antikörper, die aus isolierten B-Zellen aus dem Liquor von Patientinnen mit NMDA-Rezeptor- Enzephalitis stammen, und nativen IgA-Antikörpern aus dem Serum einer Patientin mit Multipler Sklerose. Zunächst wurde durch immunhistochemische Färbungen von Hirnschnitten eine Reaktivität der Antikörper gegen zentralnervöses Gewebe bestätigt. In nachfolgenden, optimierten Schritten wurden mittels Immunpräzipitation, Gelelektrophorese, Western Blot, Färbung von transfizierten HEK-Zellen und Massenspektrometrie die genauen Zielantigene bestimmt. Ergebnisse: Mithilfe des entwickelten Protokolls wurde GFAP als Zielantigen der beiden monoklonalen Autoantikörper identifiziert. Es stellte sich heraus, dass die Autoantikörper aus Serum natives MBP, nicht aber das Protein in seiner denaturierten Struktur als Zielantigen erkennen. Schlussfolgerung: In Zusammenschau der Ergebnisse anderer Studien wird deutlich, dass Autoantikörper gegen GFAP keine Seltenheit sind und dass eine pathogene Wirkung von GFAP-Autoantikörpern mit spezifischen Symptomen und Komplikationen möglich ist. Deshalb sollte das Autoantigen GFAP in das Standard-Panel der Diagnostik von Antikörper-vermittelten Enzephalitiden aufgenommen werden. Die hier identifizierten Autoantikörper gegen natives MBP zeigen, dass es durchaus relevant ist, auch nach Autoantikörpern gegen nativ-gefaltete Proteine zu screenen. Da die Klinik der Patientin nach einer immunsuppressiven Therapie stabilisiert werden konnte, scheint es plausibel, dass diese Autoantikörper auch eine pathogene Wirkung haben. Im Hinblick auf frühere Studien zu Multipler Sklerose, die ausschließlich nach Autoantikörpern gegen denaturierte Myelinassoziierte Proteine gesucht haben und variable Ergebnisse lieferten, erscheint es notwendig, erneut größere Patienten-Kollektive nach Autoantikörpern gegen native Proteinstrukturen zu untersuchen.