Die Psoriasis stellt als chronisch entzündliche Hauterkrankung Betroffene und Behandler*innen vor besondere Herausforderungen. Psoriatische Keratinozyten sind hyperproliferativ und weisen ein Differenzierungsdefizit auf. Neben systemischen bestehen auch topische Therapieoptionen. Das glykosidierte Phospholipid Inositol-C2-PAF könnte sich für die topische Behandlung der Erkrankung eignen. In auf der immortalisierten Keratinozytenzelllinie HaCaT basierenden in vitro-Modellen konnten antiproliferative und differenzierungsfördernde Effekte des Wirkstoffes nachgewiesen werden. Bei murinen in vivo-Versuchen wurde die psoriatische Krankheitsaktivität signifikant reduziert.
Im Rahmen dieser Arbeit sollten die Erkenntnisse auf primäre humane Keratinozyten und Fibroblasten erweitert werden. Dafür wurden aus Präputien isolierte Zellen in 2D-Monokulturen mit aufsteigenden Konzentrationen des Wirkstoffes behandelt. Der Einfluss auf die metabolische Aktivität der Zellen wurde mit dem MTT-Assay und der Effekt auf die Proteinmasse mit dem SRB-Assay gemessen.
Außerdem wurde eine von der Firma InSphero bereitgestellte, aus humanen primären Keratinozyten und Fibroblasten bestehende 3D-Kokultur charakterisiert. Durch die Gabe des proinflammatorischen, psoriasisrelevanten Zytokins TNFα wurde dieses 3D-Modell in einen entzündlichen Zustand versetzt. Mit Hilfe der Immunfluoreszenzanalyse wurde der Einfluss von Inositol-C2-PAF auf den Differenzierungsprozess der Keratinozyten unter entzündlichen und nicht-entzündlichen Bedingungen anhand der terminalen Differenzierungsmarker Keratin 1 und Filaggrin bestimmt.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Wirkstoff mit steigender Inkubationszeit eine steigende Potenz in der Hemmung der metabolischen Aktivität und der Proteinmasse aufweist. Dabei deutete sich an, dass die Proteinmasse bei niedrigeren Konzentrationen des Wirkstoffes gehemmt wird als die metabolische Aktivität. Darüber hinaus zeigte sich, dass Fibroblasten mit einer drei- bis fünffach erhöhten IC50 eine deutlich geringere Sensitivität gegenüber dem Wirkstoff aufweisen als Keratinozyten. Bei den Fibroblasten konnte die metabolische Aktivität in niedrigen Konzentrations-bereichen induziert werden. Das 3D-Kokultur-Modell ließ sich als adäquates Hautmodell mit einem dermalen und einem epidermalen Anteil charakterisieren. Die Epidermis zeigte einen mehrschichtigen Aufbau mit Zunahme des Differenzierungsgrades in den höheren Schichten. Es ist jedoch nicht gelungen, die Kultur mit TNFα psoriasoform inflammatorisch zu verändern. Der Effekt von Inositol-C2-PAF auf die Kultur war durch eine Erhöhung der Differenzierungsmarker Keratin 1 und Filaggrin gekennzeichnet.
As a chronic inflammatory skin disease, the psoriasis poses challenges to both patients and practitioners. Psoriatic keratinocytes are hyperproliferative and exhibit a deficit in differentiation. There are topical as well as systemic therapies available. The glycosidated phospholipid Inositol-C2-PAF may be suitable for topical treatment of the disease. In vitro-models based on the immortalized keratinocyte cell line HaCaT demonstrated antiproliferative and differentiation-promoting effects of the compound. In murine in vivo-experiments the psoriatic disease activity was significantly reduced.
In this work, these findings were extended to primary human keratinocytes and fibroblasts. Cells isolated from foreskin were grown in 2D-monocultures and were treated in the presence of increasing concentrations of the drug. To measure the effect on the metabolic activity of the cells the MTT-assay was used. The influence on the protein mass was determined using the SRB-assay.
In addition, a 3D-coculture consisting of human primary keratinocytes and fibroblasts provided by InSphero was characterized. The administration of the proinflammatory and psoriasis-relevant cytokine TNFα induced an inflammatory state in the 3D-model. Immunofluorescence analysis of two different markers of terminal keratinocyte differentiation, keratin 1 and filaggrin, was used to determine the influence of Inositol-C2-PAF on the differentiation process under inflammatory and non-inflammatory conditions.
In this work, the compound showed an increasing potency in inhibiting the metabolic activity and the protein mass in a time-dependent manner. The protein mass was inhibited at lower concentrations than the metabolic activity. In addition, fibroblasts had a significantly lower sensitivity to the drug than keratinocytes which resulted in a three- to fivefold increase of their IC50. The metabolic activity of fibroblasts was induced at low concentrations of the compound. The 3D-coculture model was characterized as an adequate skin model with a dermal and an epidermal portion. The epidermis showed a multilayered structure with an increase in the degree of differentiation in the higher layers. However, TNFα failed to induce psoriasis-like inflammatory changes in the culture. Inositol-C2-PAF induced the differentiation markers keratin 1 and filaggrin.
