Der Einfluss von Palmitoleinsäure (C16:1) auf die PI3K/AKT/FOXO und ERK 1/2 (MAPK) Signalkaskaden im Kontext physiologischer kardialer Hypertrophie

Abstract

Palmitoleinsäure (C16:1) ist eine einfach ungesättigte Fettsäure, die kürzlich durch unsere Arbeitsgruppe als wichtiger Mediator physiologischer kardialer Hypertrophie (PCH) charakterisiert wurde. Da die molekulare Wirkweise jedoch weitgehend ungeklärt ist, war das Ziel dieser Arbeit den intrazellulären Wirkmechanismus von C16:1 zu entschlüsseln. Das Hauptaugenmerk sollte hierbei auf der Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K)- Proteinkinase B (AKT)- Forkhead-Box-Protein (FOXO) Signalkaskade liegen. Murine HL-1 Kardiomyozyten wurden entweder mit bovinem Serumalbumin als Vehikel, 40 mM C16:1, 130 mM Palmitinsäure (C16:0) oder 10 nM Insulin like Growth factor-1 (IGF-1) als Positivkontrolle stimuliert. Die Stimulationsintervalle variierten hierbei zwischen 5 min und 48 h. Im Anschluss wurden Gesamt-RNA und Proteine isoliert und mittels qRT-PCR und Western Blot analysiert. Darüber hinaus wurden Immunfluorenz-Assays durchgeführt. Hierzu wurden die immungefärbten Zellen mit einem invertierten Fluoreszenz-Phasenkontrast-Mikroskop vergrößert und mit der BZ-II Analyser Software analysiert. Zuletzt wurde ebenfalls der Effekt von C16:1 auf den Mitogen-activated Protein Kinases (MAPK)- Extracellular-signal regulated Kinases (ERK) Signalweg betrachtet. Die atrophieregulierenden FOXO-Transkriptionsfaktoren 1 und 3a zeigten sich nach einer 30-minütigen C16:1 Stimulation durch Phosphorylierung inaktiviert. Zudem beobachteten wir eine Reduktion der FOXO 1 und 3a Gesamtproteinmenge infolge 18-stündiger C16:1 Stimulation. Mittels Immunfluoreszenzmikroskopie konnte die C16-induzierte zytoplasmatische Translokation von FOXO3a nachgewiesen werden. Das Genexpressionslevel des FOXO3a-Zielgens p21 erwies sich nach 24-48 h C16:1 Stimulation signifikant hochreguliert. Ferner zeigte sich die wachstumsfördernde AKT-Kinase durch C16:1 aktiviert. Die Zellzyklus-regulierende Kinase ERK 1/2 präsentierte eine Inaktivierung mittels Dephosphorylierung infolge der C16:1 Stimulation. Zusammenfassend konnten AKT, FOXO und ERK 1/2 als intrazelluläre Schlüsselmediatoren von C16:1 in Kardiomyozyten identifiziert werden. Es konnte gezeigt werden, dass nicht nur die Aktivierung der wachstumsfördernden AKT-Kinase, sondern auch die Hemmung der atrophieregulierenden FOXO-Proteine bei der PCH eine zentrale Rolle spielt. Darüber hinaus scheint C16:1 durch die Inaktivierung von ERK 1/2, möglicherweise auch die Proliferation von Kardiomyozyten zu regulieren. Somit ist es naheliegend, dass die Effekte von C16:1 auf die kardiale Hypertrophie über die Beeinflussung von AKT/FOXO und ERK 1/2 vermittelt werden. Diese Studie liefert ein Hinweis darauf, dass die Fettsäure C16:1 molekulare kardioprotektive Effekte vermittelt, die zukünftig sowohl potentiell in der Prophylaxe als auch in der Therapie kardiovaskulärer Erkrankungen von Bedeutung sein könnten.

We have previously identified palmitoleic acid (C16:1) as a novel regulator of physiological cardiac hypertrophy. Since the underlying mechanisms of the C16:1-induced cardiac effects remain uncertain, we aimed to further investigate the molecular cell signaling pathways behind the C16:1-mediated cardiac responses. The primary focus of this study was set on examining the effects of C16:1 on the PI3K-AKT-FOXO signaling pathway, related to cardiac hypertrophy. The murine HL-1 cardiomyocytes were stimulated with either vehicle, 40 mM C16:1, 130 mM C16:0 as well as 10 nM IGF-1 (positive control) between 5 mins to 48 h. Subsequently total-RNA and proteins were isolated and examined by performing qRT-PCR or Western Blot analysis. In addition, immunofluorescence staining was conducted. Furthermore, the impact of C16:1 on MAPK/ERK signaling was also examined. The FOXO transcription factors 1 and 3a revealed to be phosphorylated and therefore inactivated by a 30 min C16:1 stimulation. Moreover, the cells total abundance of FOXO1 and FOXO3a was significantly diminished upon an 18 h C16:1 treatment. As demonstrated by immunofluorescence staining, C16:1 stimulation furthermore resulted in the cytosolic translocation of FOXO3a. The expression level of the FOXO3a target gene p21 proved to be significantly upregulated upon 24-48 h of C16:1 treatment. The growth-promoting AKT kinase was activated by C16:1 treatment, indicating yet another involvement of the AKT-FOXO signaling pathway in C16:1-induced cardiac responses. In addition, the cell cycle-regulating kinase ERK 1/2 demonstrated to be significantly decreased upon C16:1 stimulation. In conclusion, we were able to identify the C16:1-mediated regulation of AKT, FOXO and ERK 1/2 in cardiomyocytes. As FOXO is known to promote protein degradation and cell atrophy, its inactivation may play a crucial role in mediating physiological cardiac hypertrophy. By activating the growth-promoting kinase AKT, C16:1 ultimately enables pro-hypertrophic cardiac effects. The inactivation of ERK 1/2, being a fundamental regulator of cell cycle progression, indicates that while cell hypertrophy is being promoted, C16:1 may inhibit cell proliferation. This study revealed several molecular targets within the AKT-FOXO as well as the MAPK- signaling pathways that seem to be involved in mediating the previously shown, C16:1-induced beneficial cardiac growth processes. Therefore, it is probable that the effects of C16:1 on cardiac hypertrophy are mediated by affecting the AKT/FOXO as well as the ERK 1/2 signaling pathway. As C16:1 induces physiological cardiac growth, our study may contribute to develop potential future lipid-based therapies for cardiac diseases such as cardiomyopathy or heart failure.