Expression Analyses of CLCA Members in the Feline Respiratory Tract – Biomolecules in Feline Asthma?

Abstract

Certain members of the highly conserved chloride channel regulator, calcium-activated (CLCA) family have been implicated in inflammatory mucus-based respiratory conditions such as asthma, chronic obstructive pulmonary disease or cystic fibrosis which may either occur naturally or may be experimentally induced in animal species to model the respective human disease. CLCA1, the most intensively investigated member of this family to date, was shown to be highly expressed in these respiratory diseases and had been discussed as a therapeutic target. The CLCA family has been systematically characterized in naive and diseased conditions in humans and mice, and, to a lesser extent, in horses and naive pigs. It has not only revealed strong similarities but also distinct species-specific differences in genetic organization or protein structure and expression pattern, with partially functional contradictory results, particularly between human and murine CLCA orthologs. These interspecies differences are further complicated by possible redundancies or compensatory effects of homologous CLCA members and may limit the value of mouse models. Hence, caution is warranted in translating results from one species to another. Asthma is a highly relevant and naturally occurring disease not only in horses but also in cats, in which it shares many characteristics with the human disease. The feline CLCA family is, however, unknown to date. Hence, this study aimed at characterizing the gene and protein structure of the CLCA family in comparison to the orthologs of other well-investigated species, i.e. humans, mice, and pigs. Furthermore, it aspired at elucidating the mRNA and protein expression profile of feline CLCA members in healthy cats for the first time, particularly in the respiratory tract. Last but not least, it aimed gathering first evidence of allegedly differential expressional regulation of CLCA1 in feline asthma. It could be shown that the feline CLCA orthologs are grouped into four clusters, identical to all other species investigated to date with typical conservation of CLCA1 and CLCA2 on the genomic level. However, the cat possesses single and fully functional CLCA members not only in clusters 1 and 2 but, in contrast to all other species, both in clusters 3 and 4, which, hence, makes the cat particularly relevant in studying these individual CLCA members. Regarding CLCA1, the feline ortholog not only shows an identical genetic and protein structure as compared to the other species investigated, but also concerning its tissue expression pattern. In the naive respiratory tract, CLCA1 immunohistochemically localized to virtually all mucus cells and was found to be secreted extracellularly mucus. This expression pattern identical to all other species analyzed to date may point toward a conserved function of CLCA1 in this microenvironment. However, feline CLCAA1 was not detected in submucosal glands in which it is expressed in all aforementioned species. This niche seems to be occupied by a different CLCA member, CLCA3, in the cat. Surprisingly and in contrast to all aforementioned species, feline CLCA2 was neither found in SMGs nor in any other cell type of the feline respiratory tract, hence, excluding any possible compensatory or synergistic effect of CLCA2 in the cat, as had been proposed for CLCA2 in other species, at least during homeostatic conditions. The allegedly soluble protein CLCA3 was primarily found in ciliated respiratory epithelial cells and, importantly, also in mucus-producing SMG cells of the upper respiratory tract, similar to its murine orthologs CLCA3a1 and -3a2. It therefore appears that in cats, CLCA3 may substitute for the lack of CLCA1 and CLCA2 specifically in SMGs, with possible overlapping functions in that microenvironment. Similar to mice, but in contrast to man and pigs, the feline respiratory tract was devoid of CLCA4 expression. In the airways of asthmatic cats, CLCA1 intensely labelled the entire bronchial mucus layer, identical to all other species exhibiting chronic respiratory conditions with increased mucus production. This seemingly increased CLCA1 secretion cat may indicate a similar function as considered for human asthma patients and respective animal models. It is suggestive of a role in feline asthma in which it may serve as a biomarker and/or therapeutic target and needs to be investigated in future studies in detail. However, fundamental species-specific differences of other CLCA family members on the genomic and protein level may also imply functional diversity in homeostatic and challenged airways and, hence, may modulate the respiratory conditions differently and thereby impede the translatability of animal models. Therefore, an in-depth understanding of the heterogeneity of this gene family is required, especially concerning the respiratory tract.

Mitglieder der hochkonservierten Chloridkanal-Regulator, Calcium-aktiviert (CLCA)-Familie werden mit entzündlichen, Mukus-basierten Atemwegserkrankungen wie Asthma, chronisch obstruktiver Lungenerkrankung oder zystischer Fibrose assoziiert, die in verschiedenen Tierspezies entweder natürlicherweise vorkommen oder experimentell induziert werden können, um die humane Erkrankung zu modellieren. CLCA1, das bislang am intensivsten untersuchte Mitglied dieser Familie, ist bei diesen Atemwegserkrankungen stark exprimiert und wurde daher als therapeutisches Target diskutiert. Die CLCA-Familie wurde bereits systematisch in gesunden und erkrankten Menschen und Mäusen, und in geringerem Umfang auch in Pferden und gesunden Schweinen charakterisiert. Dabei wurden nicht nur deutliche Ähnlichkeiten, sondern auch speziesspezifische Unterschiede in genetischer Organisation, Proteinstruktur und Expressionsmuster festgestellt, teils mit funktionell widersprüchlichen Ergebnissen, insbesondere zwischen menschlichen und murinen CLCA-Orthologen. Diese speziesspezifischen Unterschiede werden vermutlich durch Redundanzen oder kompensatorische Effekte homologer CLCA-Vertreter weiter erschwert und können die Aussagekraft von Mausmodellen einschränken. Daher ist bei der Übertragung von Ergebnissen von einer Spezies auf eine andere Vorsicht geboten. Asthma ist eine hochrelevante und natürlicherweise vorkommende Erkrankung nicht nur bei Pferden, sondern auch bei Katzen, die viele Merkmale mit der humanen Erkrankung teilt. Die feline CLCA-Familie ist jedoch bislang unbekannt. Ziel dieser Arbeit war daher die Charakterisierung der Gen- und Proteinstruktur im Vergleich zu den Orthologen anderer gut untersuchter Spezies Mensch, Maus und Schwein. Darüber hinaus sollte erstmals das mRNA- und Proteinexpressionsprofil der felinen CLCA-Mitglieder in gesunden Katzen, insbesondere im Respirationstrakt, untersucht werden. Zudem wurde angestrebt, erste Hinweise auf eine mögliche differentielle Expressionsregulation von CLCA1 bei felinem Asthma zu sammeln. Es konnte gezeigt werden, dass sich die felinen CLCA-Orthologe, wie in allen anderen bisher untersuchten Spezies, mit typischer genomischer Konservierung von CLCA1 und CLCA2 in vier Cluster gruppieren. Allerdings besitzt die Katze jeweils ein einzelnes und voll funktionsfähiges CLCA-Mitglied nicht nur in den Clustern 1 und 2, sondern, im Gegensatz zu allen anderen bislang untersuchten Spezies, auch in den beiden anderen Clustern, wodurch die Katze besonders relevant für die Untersuchung einzelner CLCA-Mitglieder erscheint. Bezüglich CLCA1 zeigt das feline Ortholog nicht nur eine nahezu identische Gen- und Protein-Struktur im Vergleich zu den anderen untersuchten Spezies, sondern auch bezüglich seines Gewebeexpressionsmusters. Im gesunden Respirationstrakt ist CLCA1 immunhistochemisch in nahezu allen Becherzellen lokalisiert und wird extrazellulär in den Schleim sezerniert. Dieses zu allen anderen bisher untersuchten Spezies identische Expressionsmuster weist auf eine Konservierung auch der Funktion von CLCA1 in dieser Mikroumgebung hin. Felines CLCA1 wurde jedoch nicht in den submukösen Drüsen, in denen der jeweilige Orthologe der vorgenannten Spezies exprimiert wird, nachgewiesen. Diese Nische scheint von einem anderen felinen CLCA-Mitglied, CLCA3, besetzt. Darüber hinaus wurde überraschenderweise und im Gegensatz zu allen genannten Spezies felines CLCA2 weder in submukösen Drüsen noch in einem anderen Zelltyp des felinen Respirationstraktes gefunden, was einen kompensatorischen oder synergistischen Effekt von CLCA2, wie bereits für andere Spezies vermutet, bei der Katze zumindest unter homöostatischen Bedingungen ausschließt. Das vermutlich lösliche Protein CLCA3 wurde vorwiegend in respiratorischen Flimmerepithelzellen und schleimproduzierenden submukösen Drüsen des oberen Respirationstraktes nachgewiesen, ähnlich seiner murinen Orthologen CLCA3a1 und 3a2. Somit scheint CLCA3 das Fehlen von CLCA1 und CLCA2 speziell in submukösen Drüsen der Katze zu kompensieren, mit entsprechend denkbaren, überlappenden Funktionen in dieser Mikroumgebung. Ähnlich wie bei Mäusen, aber im Gegensatz zu Menschen und Schweinen, ist CLCA4 im felinen Respirationstrakt nicht exprimiert. In den Atemwegen asthmatischer Katzen war CLCA1 in der extrazellulären Mukusschicht stark exprimiert, wie bei allen anderen Spezies mit chronischen Atemwegserkrankungen mit erhöhter Schleimproduktion. Diese scheinbar erhöhte CLCA1-Sekretion bei asthmatischen Katzen könnte auf eine ähnliche Funktion bei felinem Asthma wie für Asthmapatienten und entsprechende Tiermodelle bereits vermutet hindeuten, die als Biomarker und/oder therapeutisches Target genutzt werden könnte und in zukünftigen Studien en détail untersucht werden muss. Es ist jedoch zu beachten, dass grundlegende speziesspezifische Unterschiede anderer Mitglieder der CLCA-Familie auf Genom- und Proteinebene eine funktionelle Diversität und somit Modulation in gesunden und erkrankten Atemwegen hervorrufen und dadurch die Übertragbarkeit von Tiermodellen erschweren können. Daher ist ein tieferes Verständnis der Heterogenität dieser Genfamilie, insbesondere in Bezug auf den Respirationstrakt, erforderlich.