New Methods for Automated Glycan Assembly to Prepare Different Classes of Glycans

Abstract

Carbohydrates are the most abundant biomolecules on earth and play pivotal roles in biological events. These carbohydrates exist as polymers, and as glycoconjugates, are connected to proteins, peptides, and lipids. Consequently, tremendous efforts to understand functions of carbohydrates have been made. Automated solid-phase oligosaccharide synthesis showed possibilities to make synthetic routes straightforward and streamlined for even non- specialists as a general and robust instrument like DNA and peptide synthesizer. Tremendous efforts were made over the past decades to advance automated systems and to produce various structures of oligosaccharides. In the extension of these investigations, the ultimate goal of this thesis is to show the possibility to establish the logic of automated glycan assembly (AGA) by developing new methods for automated glycan assembly to prepare different classes of glycans. Therefore, various oligosaccharides using generalized protocols have been procured and conjugation-ready carbohydrates serve as molecular tools. After a comprehensive introduction into automated oligosaccharide synthesis in Chapter 1, Chapter 2 describes the automated glycan assembly of oligo-N-acetyllactosamine (oligo-LacNAc) and keratin sulfates using building blocks bearing three temporary protecting groups. Following purification protocols using HPLC allowed for access to a small library of linear and branched LacNAc structures including sulfated KSs. Additionally, glycan microarray screening performed using seven LacNAc structures and fluorescence-labeled recombinant AAV particles revealed that one specific virus, AAV 10 identified disulfated tetrasaccharide LacNAc as a relevant epitope. Automated synthesis of oligosaccharides containing challenging 1,2-cis-glycosidic linkages or disarmed building blocks is demonstrated in Chapter 3. Assembly of Lc4 and nLc4 core structures containing only 1,2-trans-glycosidic linkages was executed with building blocks employing a participating group at C2. The stereoselective installation of α-(12)- fucosidic linkage was achieved with the corresponding fucose building blocks depending on the sequence of the core structure, Lc4 or nLc4 in order to synthesize H-type I and II. For the synthesis of three α-Gal epitopes, the last glycosylation reaction formed α-(13)-galactosidic linkage. The stereoselectivity was found to be affected by the sequence of the acceptor bound to the solid support. Identification of the most reactive glucuronic acid building block bearing Lev protecting group on 3-O allowed for the synthesis of HNK-1 epitope pentasaccharide in strictly linear approach. From this investigation it was concluded that identification of approved building blocks was key to accomplish the assembly of synthetically challenging oligosaccharides by using AGA. Chapter 4 of this dissertation presents the automated synthesis of oligosaccharides containing challenging 1,2-cis glycosidic linkages, one of the most challenging carbohydrates to date. In contrast to previous result, leaving groups affected the automated installation of α- galactosidic or β-mannosidic linkages. Remote participation effects by acetyl group(s) at C3 and C4/C6 was in depth studied to identify a set of building blocks introducing 1,2-cis glycosidic linkages with good to excellent stereoselectivity. Taking advantage of “approved” building blocks enabled the synthesis of Globo-H and α-glucans containing multiple 1,2-cis glycosidic linkages. As a result of researches performed in previous Chapters 2 to 4, Chapter 5 describes the reliable and rapid assembly of oligosaccharides using the commercially available automated glycan synthesizer, Glyconeer 2.1, monosaccharide building blocks, and a linker- functionalized polystyrene solid support. Protocols for purification using HPLC and quality- control using IM-MS for the oligosaccharide products have been standardized. Synthetic glycans prepared in this way are useful reagents as the basis for glycan arrays, diagnostics, and carbohydrate based vaccines.

Kohlenhydrate sind die am häufigsten vorkommenden Biomoleküle auf der Erde und spielen wichtige Rollen in unzaehligen biologisches Prozessen. Kohlenhydrate sind als Polymere oder Glykokonjugate an Proteine, Peptide und Lipide gebunden und modulieren deren Funktionen. Folglich wurden signifikante Anstrengungen unternommen, um die verschiedenen Funktionen von Kohlenhydraten zu verstehen. In den vergangenen Jahren wurde umfangreich in die Forschung zur Entwicklung automatisierter Festphasen-Oligosaccharidsyntheseplattformen investiert. Diese Instrumente eröffnen Möglichkeiten zur Straffung und Automatisierung von Synthesewegen und machen komplexe Synthesen für Laien zugänglich, ähnlich wie DNA- und Peptidsynthesizers. Das Ziel der vorliegenden Arbeit liegt darin, eine Logik zur automatisierten Glycan- Assemblierung (AGA) zu entwickeln, wodurch die Synthese von Oligosacchariden unter Verwendung verallgemeinerter Protokolle moeglich wird. Konjugationsfertige Kohlenhydrate haben in den letzten Jahren als molecular Werkzeuge besonders in biomedizinischen Anwendungen an Bedeutung gewonnen. Kapitel 1 dient einer umfassenden Einführung in die automatisierte Oligosaccharidsynthese. Kapitel 2 beschreibt eine automatisierte Glycansynthese von Oligo- N-acetyllactosamin (Oligo-LacNAc) und Keratinsulfaten unter Verwendung von Bausteinen, die drei temporäre Schutzgruppen tragen. Anschliessende Reinigungsprotokolle unter Verwendung von HPLC ermöglichten die Isolierung einer kleinen Library von linearen und verzweigten LacNAc-Strukturen einschließlich sulfatierter KS. Ein Glycan-Microarray screen unter Verwendung von sieben LacNAc-Strukturen und fluoreszenz-markierter rekombinanten AAV-Partikel zeigte, dass ein spezifisches Virus, AAV 10, disulfatiertes Tetrasaccharid LacNAc als relevantes epitop erkannte. Kapitel 3 beschreibt die automatisierte Synthese von Oligosacchariden mit schwierigen 1,2-cis-Glycosidbindung oder “disarmed” Bausteinen. Die Synthese von Lc 4 und nLc 4 Kernstrukturen, die nur 1,2-trans-glycosidische Bindungen enthielten, wurden mit Bausteinen durchgefuehrt die eine teilnehmende Gruppe bei C2 aufweisen. Die folgende stereoselektive Installation einer α-(1-->2)-Fucosidbindung wurde mit den entsprechenden Fucose-Bausteinen erreicht, abhängig von der Sequenz der Kernstruktur, Lc 4 oder nLc 4, um H-Typ I und II zu synthetisieren. Für die Synthese von drei α-Gal-Epitopen, die letzte Glykosylierungsreaktion formte eine α-(1-->3) -galactosidische Bindung. Die Stereoselektivität wurde durch die Sequenz des Akzeptors, das an die Festphase gebunden ist, beeinflusst. Identifizierung der reaktivsten Glucuronsäure-Baustein, das Phosphat das die Lev-Schutzgruppe an 3-O einsetzt, erlaubte die Synthese von HNK-1-Epitop-Pentasaccharid in einem streng linearen process. Diese Untersuchungen ergaben, dass die Identifizierung zugelassener Bausteine der Schlüssel zum Bau synthetisch herausfordernder Oligosacchariden mit AGA darstellt. In Kapitel 4 dieser Dissertation wird die automatisierte Synthese von Oligosacchariden mit schwierigen 1,2-cis-glykosidischen Bindungen, vorgestellt. Die austretende Gruppen wirkten sich auf die Installation von α-galaktosid oder β- mannosidisches Bindungen aus Fernbeteiligungseffekte von Acetyl Gruppe (n) an C3 und C4 / C6 wurden eingehend untersucht, um eine Reihe von Bausteinen zu identifizieren, die einführten 1,2-cis-glycosidische Bindungen mit guter bis ausgezeichneter Stereoselektivität. Die Nutzung von "zugelassenen" Bausteinen ermöglichte die Synthese von Globo-H- und α- Glucanen mit mehreren 1,2-cis-glycosidische Bindungen. Basierend auf der Arbeit die in den Kapiteln 2 bis 4 durchgeführten wurden, bschreibt Kapitel 5 eine zuverlässige und schnelle Synthese von Oligosacchariden unter Verwendung eines kommerziellen automatisierten Glykansynthesizers, Glyconeer 2.1, Monosaccharid- Bausteinen und einer linker-funktionalisierter Polystyrol-Festphase. Protokolle zur Reinigung mittels HPLC und Qualitaetskontrolle der Oligosaccharidprodukte mittels IM-MS wurden standardisiert. Auf diese Weise hergestellte Glykane sind nützliche Reagenzien für Glykanarrays, Diagnostika, und Kohlenhydrat-basierte Impfstoffe.