Einfluss der Zusammensetzung der myeloiden Zellpopulation auf die Expression alternativer proangiogener Faktoren durch Mikroglia/Makrophagen im humanen Glioblastom

Abstract

Einleitung: Die hochmalignen Glioblastome (GBM) zeichnen sich durch eine gesteigerte Vaskularisierung aus. Es gibt Hinweise darauf, dass myeloide Zellen als Teil der Mikroumgebung des Glioblastoms Anteil an der erhöhten proangiogenen Aktivität im Tumor und auch an der Entwicklung von Therapieresistenz gegen antiangiogene Wirkstoffe haben. In dieser Arbeit sollte eine vertiefende Charakterisierung der proangiogenen Eigenschaften der Mikroglia/Makrophagen und Granulozyten als Vertreter der myeloiden Zellen im humanen Glioblastom vorgenommen werden. Methoden: Gewebeproben von GBM-, Astrozytom °III- und Epilepsiepatienten wurden direkt postoperativ prozessiert und für die Isolation von CD11b+-Zellen mittels MACS-Technologie, FACS-Färbungen oder Immunfluoreszenzfärbungen auf Gefrierschnitten verwendet. Im FACS wurden typische M1/M2-Aktivierungsmarker der Mikroglia/Makrophagen gruppenabhängig untersucht, während in den Immunfluoreszenzfärbungen proangiogene Moleküle in Kofärbung mit Iba1 und CD66b dargestellt wurden. Gefäßassoziationen und -struktur wurden mittels CD31-CD66b-Iba1-Kofärbung untersucht. Aus den isolierten Zellen wurde RNA gewonnen, umgeschrieben und für quantitative Realtime-PCRs sowohl von proangiogenen Faktoren als auch den Aktivierungsstatus beschreibenden Molekülen verwendet. Mithilfe der Online-Datenbank Cbioportal wurden Überlebenskurven anhand der Molekülexpression erstellt und die Überlebenszeit mittels CIBERSORT mit den vorhandenen myeloiden Zellpopulationen korreliert. Ergebnisse: Anhand der FACS-Analyse erfolgte eine Unterteilung der GBM-Patienten in eine Gruppe mit höherem (GBM-hPMNL) und niedrigerem (GBM-lPMNL) Neutrophilenanteil an der myeloiden Zellpopulation. Eine eindeutige M1/M2-Polarisierung der Mikroglia/Makrophagen konnte nicht festgestellt werden, jedoch war eine Hochregulation von CD86, CD45, CD163, TIE2 und HLA ABC in der GBM-hPMNL-Gruppe zu beobachten, was auf einen veränderten Aktivierungsstatus hinweist. Zudem konnte bei den Mikroglia/Makrophagen eine erhöhte Expression alternativer proangiogener Faktoren wie CXCL2 und CD13 im Vergleich zur Epilepsie , Astrozytom- und GBM-lPMNL-Gruppe gefunden werden. Die Granulozyten der GBM-hPMNL-Gruppe partizipierten über Produktion von IL-8 und CD13 an der Angiogenese. Zusätzlich zeigte sich in der GBM-hPMNL-Gruppe eine veränderte Gefäßstruktur mit erhöhtem mittleren Gefäßdurchmesser und vermehrter Assoziation der Gefäße mit Iba1+-Zellen im Vergleich zu den anderen untersuchten Gruppen. Mit erhöhter Neutrophilenfraktion, CD45- und CSF3-Expression sowie IL-8-Produktion im gesamten GBM war ein Überlebensnachteil assoziiert. Schlussfolgerung: Die Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen den Einfluss der myeloiden Zellpopulation in der direkten Tumorumgebung. Die Neutrophilenfraktion scheint hierbei einen Einfluss auf den Aktivierungsstatus, Phänotyp und die proangiogenen Eigenschaften der Mikroglia/Makrophagen zu haben, wobei einige Moleküle, die zu potentiellen reziproken Interaktionen beitragen können, identifiziert werden konnten. Beide myeloide Zellpopulationen können durch Partizipation an der Produktion proangiogener Faktoren zur Angiogenese im humanen GBM beitragen und so die Entwicklung einer Resistenz gegen die bisherigen antiangiogenen Therapeutika unterstützen. Auf dieser Arbeit aufbauende Untersuchungen könnten somit dazu beitragen, die Immuntherapien im humanen GBM weiterzuentwickeln und sie unter Einbeziehung der myeloiden Zellpopulationen anzupassen.

Introduction: The highly malignant glioblastoma (GBM) is characterized by increased vascularization. Myeloid cells as part of the GBM microenvironment may participate in the enhanced proangiogenic activity of the tumor and in development of therapy resistance to antiangiogenic agents. Therefore, the aim of this study was to deepen the characterization of proangiogenic features of myeloid cells like microglia/macrophages and neutrophils in human glioblastoma. Methods: Tissue samples of patients with GBM, astrocytoma °III and epilepsy were directly processed postoperative and used for isolation of CD11b+ cells by MACS technology, FACS-staining or immunofluorescence staining on frozen sections. During FACS-analyses, typical M1/M2 activation markers of microglia/macrophages were examined depending on groups. Furthermore, proangiogenic factors were analyzed by Iba1 and CD66b costain by immunofluorescence. The association of myeloid cells with tumor blood vessels as well as vasculature were analysed by CD31-CD66b-Iba1 co-staining. RNA was obtained from isolated cells and used for quantitative realtime-PCR of proangiogenic factors as well as activation markers. To evaluate clinical relevance, survival data were extracted from online database Cbioportal, analyzed regarding molecule expression and correlated with present myeloid cell populations by CIBERSORT. Results: Based on the neutrophil fraction by FACS-analyses, a classification of GBM patients into a group with high (GBM-hPMNL) and low (GBM-lPMNL) percentage of neutrophils was established. While microglia/macrophages could not be assigned to a specific M1/M2-polarization, upregulations of CD86, CD45, CD163, TIE2 and HLA ABC in GBM-hPMNL group were detected, indicating a distinct activated phenotype. Additionally, microglia/macrophages in this group showed an increased expression of alternative proangiogenic factors like CXCL2 and CD13. Granulocytes of GBM-hPMNL-group participated in angiogenesis by expression of IL-8 and CD13. Moreover, a distinct vessel structure with increased mean diameter and association of vessels with Iba1+ cells were observed in GBM-hPMNL tissues compared to the other groups. A survival disadvantage was related to higher neutrophil proportion, CD45, IL 8 and CSF3 expression. Conclusion: The data of this study demonstrated the importance of myeloid cells in the tumor microenvironment. The neutrophil fraction seems to have an impact on activation status, phenotype and proangiogenic features of microglia/macrophages, Potential molecules responsible for reciprocal interaction between both myeloid cell populations were identified. Microglia/macrophages and granulocytes are able to promote angiogenesis in human GBM by expression of alternative proangiogenic factors and therefore might support the development of therapy resistance to antiangiogenic agents. Future studies based on this work could improve immunotherapies by involving the myeloid cells for therapeutic approaches in human GBM.