Expression von CALEB/NGC im embryonalen Mausgehirn

Abstract

Die Gehirnentwicklung beinhaltet ein Zusammenspiel diverser Moleküle. Das Transmembranprotein CALEB/NGC (Chicken acidic leucine-rich EGF-like domain containing brain protein/Neuroglycan C) ist Teil davon. Es besitzt ein Expressionsmaximum zum Zeitpunkt der Gehirnentwicklung, ist im postnatalen Gehirn vorwiegend an neuritenreiche Regionen gebunden und an Neuritenwachstum, Dendritenverzweigung und der Synapsenfunktion beteiligt (Watanabe et al., 1995; Schumacher et al., 1997; Aono et al., 2000; Inatani et al., 2000; Schumacher und Stübe, 2003; Hassel et al., 2003; Jüttner et al., 2005; Nakanishi et al., 2006; Brandt et al., 2007, 2008). Das Vorkommen und die Funktion im embryonalen Gehirn sind jedoch bislang weitestgehend unerforscht. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit das Expressionsmuster von CALEB/NGC im Mausgehirn sowie der Mausretina vom 14. Embryonaltag bis zum ersten postnatalen Tag mittels indirekter Immunhistochemie untersucht. Für die Studie wurde ein gegen den extrazellulären Proteinbereich gerichteter Antikörper verwendet. Die Ergebnisse wurden mittels eines zweiten CALEB/NGC-Antikörpers verifiziert, der zuvor gegen den rekombinanten, intrazellulären Proteinbereich affinitätsgereinigt wurde. Im Immunblot wurden die benutzten Antikörper auf ihre Spezifität überprüft. Die Studie wurde desweiteren durch Kofärbungen mit DAPI und Antikörpern gegen Reelin, Doublecortin, Nestin, Calbindin und Tau-1 ergänzt. Die immunhistochemischen Untersuchungen mit dem hochspezifischen CALEB/NGC-Antikörper zeigten ein örtlich und zeitlich differenziertes Expressionsmuster mit einer Anreicherung in neuritenreichen und kernarmen Regionen des Gehirns. Es fand sich eine starke, schichtspezifische Expression im Neokortex, Hippocampus, Bulbus olfactorius, Cerebellum und in der Retina. Es fiel überdies eine markante Expression im Striatum sowie in Mittellinienregionen auf, insbesondere im Chiasma opticum, der Commissura posterior und in den Nestin-positiven Mittellinienglia des ventralen Mesencephalon, des Pons und der Medulla oblongata. Zudem zeigte sich eine Expression um Fasertrakte wie die hippocampalen Fimbrien, den Alveus und den Fornix. Die Kofärbungen wiesen auf eine Expression von CALEB/NGC in einigen Doublecortin-exprimierenden jungen (migrierenden) Neuronen sowie Nestin- exprimierenden Radialglia, Mittellinienglia und Proneuronen/Stammzellen hin. Die Ergebnisse der immunhistochemischen Färbungen verifizieren das Vorkommen von CALEB/NGC im embryonalen Mausgehirn und identifizieren erstmalig das Expressionsmuster im gesamten Gehirn. Das dominierende Vorkommen in neuritenreichen Strukturen deutet auf einen Zusammenhang von CALEB/NGC mit Neuriten-assoziierten Vorgängen in der embryonalen Gehirnentwicklung hin. Zudem offenbart die Mittellinienexpression an Axonkreuzungsstellen und um einige Fasertrakte eine mögliche Beteiligung an Axonlenkungsvorgängen. Aufgrund der Expression in Doublecortin-positiven migrierenden Neuronen und in den Radialglia könnte CALEB/NGC überdies einen neuen potentiellen Akteur in der Zellmigration darstellen.

Brain development is comprised of the interaction of diverse molecules. CALEB/NGC (Chicken acidic leucine-rich EGF-like domain containing brain protein/ Neuroglycan C) is one of these. This transmembrane protein has its peak expression during brain development. It is found in the postnatal brain in neurite rich regions and takes part in neurite growth, dendritic branching and synapse function (Watanabe et al., 1995; Schumacher et al., 1997; Aono et al., 2000; Inatani et al., 2000; Schumacher und Stübe, 2003; Hassel et al., 2003; Jüttner et al., 2005; Nakanishi et al., 2006; Brandt et al., 2007, 2008). The expression and the function of CALEB/NGC in the prenatal brain, however, are basically unknown. In order to explore this, the expression pattern of CALEB/NGC in the mouse brain and retina from embryonic day 14 until the first postnatal day was analyzed via indirect immunofluorescence. An antibody directed against the extracellular part of the protein was used and the results were verified with the use of a second, affinity purified CALEB /NGC-antibody directed against the intracellular protein part. The specificity of the utilized antibodies was tested with immunoblot. The immunohistochemistry was further supplemented by counterstaining with DAPI and Reelin-, Doublecortin-, Nestin-, Calbindin- and Tau-1-antibodies. The immunohistochemistry showed a regionally and temporally differentiated expression pattern with a concentration of CALEB/NGC in neurite-rich regions of the brain. A strong, layer specific expression was detected in the cerebral cortex, hippocampus, olfactory bulb, cerebellum and retina. There was a prominent expression in the striatum as well as in the midline regions, particularly the optic chiasm, the posterior commissure and the nestin- positive midline glia of the ventral mesencephalon, pons and medulla oblongata. It also appeared around certain fiber tracts such as the hippocampal fimbria, the alveus and the fornix. The counterstains indicated an expression of CALEB/NGC by some doublecortin-expressing young (migrating) neurons as well as by nestin-expressing radial glial cells, midline glia and proneurons/stem cells. This is the first time the expression pattern of CALEB/NGC in the whole brain of the embryonic mouse has been identified. The dominating expression in neurite-rich structures indicates a correlation of CALEB/NGC with neurite-associated processes during embryonic brain development. Furthermore, the specific expression in the midline of commissural axon tracts and around certain neural pathways implies a possible involvement in axon guidance. Based on the expression in doublecortin-positive migrating neurons and in radial glial cells a role as an actor in cell migration is also conceivable.