Karlsberg+ is a new method developed to improve the accuracy of electrostatic pKA and redox computations of titratable groups in proteins. The program describes proteins using Poisson‐ Boltzmann electrostatics like others before, but Karlsberg+ also allows protein structures to relax in response to changes of ionization states of individual groups. For that purpose, the program computes pKA values in proteins by electrostatic energy computations using a small number of optimized protein conformations derived from crystal structures. In these protein conformations hydrogen positions and geometries of salt bridges on the protein surface were determined by “self‐ consistent” geometry optimization considering the most likely protonation pattern at least at three different pHs (acidic, neutral and basic). The special treatment of salt bridges at protein surfaces by Karlsberg+ is most relevant, since they likely open at low and high pH, and justified by the results of large benchmark computations. Without conformational flexibility enhanced electrostatics the root mean square deviation (RMSD) between experimental and computed took a value of 2.7 pK units. In contrast, the RMSD obtained with Karlsberg+ was only 1.1 pK units using the same force field parameters (value of the protein dielectric constant, atomic radii and partial charges). Comparable benchmark computations were performed with two different empirical programs that are not based on continuum electrostatics, namely, PROPKA and PKAcal. PROPKA deploys an empirical, but physically motivated energy function with about 50 adjusted parameters. PKAcal uses a meaningless statistical scoring function containing 91 free parameters. PROPKA reproduced the pKA values with highest overall accuracy. However, differentiating the data set into weakly and strongly shifted experimental pKA values, PROPKA’s accuracy is found to be better if the pKA values are weakly shifted but on equal footing with that of Karlsberg+ for more strongly shifted values. PKAcal reproduces strongly shifted pKA values very badly but weakly shifted values slightly better than PROPKA. Different consensus approaches were tested combining predictions from all three methods to find a general procedure for more accurate pKA predictions. An RMSD value of 0.64 was obtained by multilinear regression of the independent predictions of all three methods being better than for any of the individual programs alone. The latest methodological advances were applied in a study of the ClC‐type proton‐chloride anti‐porter from Escherichia coli, the first transporter identified in this superfamily of chloride channels. Pathways mechanism of proton and chloride translocation and their coupling are up to now unclear. Four stable buried waters were modeled into both subunits of wild‐type (WT) EClC structure. Together they form a “water wire” connecting the assumed proton entry site on the intracellular and proton exit site on the periplasmic surface. For proton transfer to work it was necessary to assume the transient production of hydrochloride in the central chloride binding site of EClC. Results of electrostatic energy computations using Karlsberg+ and additional quantum chemical calculations suggested that protonation of chloride is energetically feasible. Based on a characterization of more than a hundred chloride occupancies and protonation states, a working model of the EClC transport cycle was constructed. Accordingly, EClC evolves through states involving up to two excess protons and between one and three chlorides which was required to fulfill the experimentally observed 2:1 stoichiometry. The proposed mechanism of coupled chloride‐proton transport in EClC is consistent with available experimental data and allows making predictions on the importance of specific amino acids, which may be probed by mutation experiments.
Karlsberg+ ist ein neues Verfahren, um die Genauigkeit elektrostatischer pKA‐ und Redoxpotenzialberechnungen von titrierbaren Gruppen in Proteinen zu steigern. Ebenso wie andere Programme basiert Karlsberg+ auf dem Poisson‐Boltzmann‐Formalismus. Es erlaubt aber darüberhinaus abhängig vom Ionisierungszustand der Residuen die Struktur des Proteins zu ändern. Dazu werden pKA‐Werte mit mehreren Proteinkonformationen, die von Kristallstrukturen abgeleitet werden, gleichzeitig berechnet. Diese Konformationen unterscheiden sich in der Lage und Geometrie von Wasserstoffatomen sowie Salzbrücken an der Proteinoberfläche und werden durch „selbstkonsistente“ Geometrieoptimierung bei mindestens drei verschiedenen pH‐Werten (sauer, neutral, basisch) erzeugt, wobei das jeweils wahrscheinlichste Protonierungsmuster berücksichtigt wird. Die besondere Behandlung von Salzbrücken an Proteinoberflächen ist dabei sehr bedeutsam, weil solche Ionenpaare bei extremen pH‐Werten typischerweise nicht stabil sind. Das wird durch die Ergebnisse umfangreicher Benchmark‐Rechnungen mit Karlsberg+ gestützt: Für die Ergebnisse aus Rechnungen mit statischen Proteinstrukturen wurde eine mittlere Standardabweichung von 2.7 pK‐ Einheiten zu den experimentellen Datenpunkten erhalten. Zum Vergleich wurde ein Wert von 1.1 pK‐ Einheiten mit Karlsberg+ erhalten, bei der gleichen Wahl der variablen Parameter (Dielektrizitätskonstante im Protein, atomare Radien und Partialladungen). Vergleichbare Benchmark‐Rechnungen wurden mit zwei empirischen Programmen, PROPKA und PKAcal, durchgeführt, die pKA‐Werte nicht aus elektrostatischen Energien berechnen. PROPKA verwendet eine empirische, physikalisch motivierte Energiefunktion mit 52 anpassbaren Parametern. PKAcal benutzt eine einzig auf Statistik beruhende Scoring‐Funktion, die über 91 freie Parameter enthält. PROPKA erreichte die höchste Genauigkeit aller Programme. Differenzierte man die experimentellen Daten zwischen stark und schwach verschobenen pKA‐Werten, so zeigte sich, dass PROPKA schwach verschobene pKA‐Werte besser reproduzierte als stark verschobene, bei denen es mit Karlsberg+ gleichauf lag. PKAcal reproduzierte starke Verschiebung sehr schlecht, war aber leicht basser als PROPKA bei schwachen Verschiebungen, d.h. einfachen pKA‐Werten. Verschiedene Konsensstrategien wurden ausprobiert, um ein allgemeines Verfahren zu entwickeln, das zu einer höheren Genauigkeit führt. Die beste Variante, eine multilineare Regression der drei unabhängigen Vorhersagen, erzielte eine Standardabweichung von nur 0.64, die besser war als für jedes der drei Programme alleine. Die methodologischen Fortschritte, die in den Vorarbeiten gemacht wurden, galt es dann anzuwenden in einer Untersuchung über die Funktionsweise eines neuartigen und ungewöhnlichen Proton‐Chlorid‐Antiporters aus der Familie der ClC‐Chloridkanäle. Der erste Transporter dieser Art (EClC) wurde in Escherichia coli vor ein paar Jahren identifiziert. Bisher ist nur wenig über seine Funktionsweise bekannt, weder über die Transportwege der Protonen und Chloriden noch über die Energetik der Transportprozesse, geschweige denn etwas über den mikroskopischen Reaktionsmechanismus. In dieser Arbeit ist es gelungen, vier interne Wassermoleküle im Innern beider Proteinketten des Transporters zu stabilisieren. Die Wassermoleküle bilden zusammen einen „Wasserdraht“, d.h. ein protonenleitende Verbindung, die den möglichen Protoneneingang auf der intrazellulären mit dem Ausgang auf der periplasmatischen Oberfläche verbinden. Damit der Protonentransport unter diesen Umständen auch funktioniert, muss jedoch angenommen werden, dass durch Protonierung eines Chlorids in der zentralen Bindungsstelle des EClCs Chlorwasserstoff zumindest transient erzeugt wird. Die Ergebnisse elektrostatischer Energieberechnungen mittels Karlsberg+ und zusätzliche quantenchemische Modellrechnungen legen nahe, dass die Bildung von Chlorwasserstoff in EClC tatsächlich möglich ist. Auf der Basis der über hundert charakterisierten Chlorid‐ und Wasserstoffbesetzungszustände von EClC wurde eine Arbeitshypothese über der Transportmechanismus aufgestellt. Danach durchläuft EClC verschiedene Zustände mit ein bis zwei Protonen und mit ein bis drei Chloriden im Transportweg. Letzteres ist notwendig, damit der Mechanismus die beobachtete 2:1 Stöchiometrie erfüllen kann. Der vorgeschlagene Mechanismus des gekoppelten Protonen‐Chlorid‐Transports in EClC passt zu den bekannten experimentellen Daten und ermöglichte es, einige Vorhersagen über die funktionelle Relevanz bisher unbeachteter Aminosäurereste zu machen, die sich durch Punktmutationsexperimente leicht verifizieren lassen.
