Orthogonal Analytical Approaches for the Investigation of Specific Metabolic Pathways of 17α-Methyltestosterone with the Focus on Hydroxylation Reactions

Abstract

Anabolic androgenic steroids (AAS) are commonly used as performance-enhancing drugs (PEDs) in sports because of their anabolic effects. Nearly half of the adverse analytical findings (AAF) in 2019 are correlated to AAS misuse [83]. The metabolization process plays an essential role in the analysis of endogenous and exogenous steroids. Therefore, investigations on drug metabolizing and steroidogenic CYP enzymes are important in antidoping research. The most common reaction catalyzed by CYP enzymes in phase-I-metabolism is the introduction of a hydroxy group. Currently, analysis of AAS is mostly performed using GC-MS systems. These methods usually correlate with laborious sample preparation and extended run times compared to LC-MS(/MS) methods. On the other hand, LC-MS(/MS) methods have a lower separation efficiency than GC-MS systems. SFC, as an orthogonal analytical approach, was used to separate the hydroxy metabolites of MT. This project aimed to get a more in-depth look at the metabolization and analysis of MT, an AAS prohibited as PED in sport by the WADA [1], focusing on hydroxylated metabolites and the aromatization process. Therefore, reference material of 2αOHMT, 2βOHMT, and 4OHMT was synthesized and characterized by HRMS and NMR. In vitro studies with HLM, CYP2C19, CYP1A2, CYP1B1, and CYP19A1 and an in vivo study with one healthy male volunteer were conducted to investigate the formation of hydroxylated MT metabolites. Because existing and developed GC-MS(/MS) and LC-MS(/MS) methods could not separate the hydroxylated metabolites of interest, an SFC-MS/MS method was developed, which gave a good separation. SFC showed its orthogonality by means of the elution order 4OHMT>2βOHMT>2αOHMT>6βOHMT, which differed from GC (2βOHTM>6βOHMT>4OHTM>2αOHMT, as per-TMS) and LC (6βOHMT>2βOHMT>2αOHMT>4OHMT). Finally, the formation of 2βOHMT in HLM and CYP2C19 incubation were verified with synthesized reference material, where CYP2C19 may show the predominant way in its formation. Additionally, the presence of 2βOHMT after CYP19A1 incubation shows its influence in the aromatization of MT. Investigation of urine samples after MT administration showed the formation of 2βOHMT, 6βOHMT, and 4OHMT. However, all three metabolites were only detected to a maximum of 22 hours after the administration and in very low concentrations. Thus, hydroxylated metabolites of MT cannot be seen as superior metabolites over the classical MT metabolites 5αTHMT and 5βTHMT [45]. Future work may focus on developing an SFC-HRMS method to investigate the formation of unknown hydroxy metabolites. As only recently described by Savill et al., incubation studies with different cell lines may be a good alternative for in vivo studies with steroids [84]. Further, the synthesis and characterization of possible metabolite structures will be the next step in investigating the hydroxylated metabolome. Boldenone is the AAS with the majority of reported AAF according to the WADA Testing Figures [83]. Therefore, boldenone, or its corresponding 17-methyl analog metandienone, might be an interesting substance for this kind of study. In addition, further experiments on the aromatization of MT with 2βOHMT and 19OHMT as substrate, and the identification of 2β,19-dihydroxymethyltestosterone as intermediate with synthesized reference material are needed.

Anabol androgene Steroide (AAS) werden aufgrund ihrer anabolen Wirkung häufig als leistungssteigernde Mittel (PEDs) im Sport eingesetzt. Fast die Hälfte der unerwünschten analytischen Befunde (AAF) im Jahr 2019 korreliert mit dem Missbrauch von AAS [83]. Eine wesentliche Rolle bei der Detektion von endogenen und exogenen Steroiden in Urinproben spielt die Metabolisierung. Daher sind Untersuchungen zu arzneimittelmetabolisierenden und steroidogenen CYP-Enzymen in der Antidopingforschung wichtig. Die häufigste Reaktion, die von CYP-Enzymen im Phase-I-Metabolismus katalysiert wird, ist die Einführung einer Hydroxygruppe. Die Analyse von AAS wird derzeit meist mit GC-MS-Systemen durchgeführt. Diese Methoden sind in der Regel mit einer aufwendigen Probenvorbereitung und längeren Laufzeiten im Vergleich zu LC-MS(/MS)-Methoden verbunden. Auf der anderen Seite haben LC-MS(/MS)-Methoden eine geringere Trenneffizienz im Vergleich zu GC-MS-Systemen. Die SFC als orthogonaler analytischer Ansatz wurde zur Trennung der Hydroxymetaboliten von MT verwendet. Ziel dieses Projektes war es, die Metabolisierung und Analyse von MT, einem von der WADA als PED im Sport verbotenen AAS [1], genauer zu untersuchen, wobei der Fokus auf hydroxylierte Metabolite und die Aromatisierung lag. Dazu wurde Referenzmaterial von 2αOHMT, 2βOHMT und 4OHMT synthetisiert und mittels HRMS und NMR charakterisiert. In vitro Versuche mit HLM, CYP2C19, CYP1A2, CYP1B1 und CYP19A1 sowie ein in vivo Versuch mit einem gesunden männlichen Probanden wurden durchgeführt, um die Entstehung von hydroxylierten MT-Metaboliten zu untersuchen. Da bestehende und entwickelte GC-MS(/MS)- und LC-MS(/MS)-Methoden nicht in der Lage waren, die hydroxylierten Metaboliten zu trennen, wurde eine SFC-MS/MS-Methode entwickelt, die eine gute Trennung ergab. Die SFC zeigte seine Orthogonalität an Hand der Elutionsfolge 4OHMT>2βOHMT>2αOHMT>6βOHMT, welche sich grundlegend von der GC (2βOHTM>6βOHMT>4OHTM>2αOHMT, als per-TMS) und der LC (6βOHMT>2βOHMT>2αOHMT>4OHMT) unterschied. Die Entstehung von 2βOHMT in HLM und CYP2C19 Inkubation mit wurde mit synthetisiertem Referenzmaterial verifiziert, wobei CYP2C19 offenbar den vorherrschenden Weg bei der Entstehung von 2βOHMT zeigt. Das Vorhandensein von 2βOHMT nach Inkubation mit CYP19A1 zeigt dessen Einfluss auf die Aromatisierung von MT. Die Untersuchung von Urinproben nach Einnahme von MT zeigte die Entstehung von 2βOHMT, 6βOHMT und 4OHMT. Alle drei Metaboliten wurden jedoch nur bis maximal 22 Stunden nach der Verabreichung und in sehr geringen Konzentrationen nachgewiesen. Somit können hydroxylierte Metabolite von MT gegenüber den klassischen MT Metaboliten 5αTHMT und 5βTHMT nicht als übergeordnet angesehen werden [45]. Zukünftige Arbeiten könnten sich auf die Entwicklung einer SFC-HRMS-Methode beschäftigen, um die Bildung von unbekannten hydroxylierten Metaboliten zu untersuchen. Wie erst kürzlich von Savill et al. beschrieben, können Inkubationsstudien mit verschiedenen Zelllinien eine gute Alternative für in vivo Studien mit Steroiden sein [84]. Die Synthese und Charakterisierung möglicher weiterer Metabolitstrukturen werden der nächste Schritt bei der Untersuchung des Phase-I-Metabolismus von MT sein. Boldenon ist das AAS mit den meisten berichteten AAF gemäß des WADA Testing Figures Report [83]. Daher könnte Boldenon oder sein entsprechendes 17-Methyl Analogon Metandienon eine interessante Substanz für diese Art von Studie sein. Zudem sind weitere Versuche zu der Aromatisierung von MT mit 2βOHMT und 19OHMT als Substrat, und die Identifizierung von 2β,19-Dihydroxymethyltestosterone als Zwischenprodukt mit synthetisierter Referenzsubstanz nötig.