The MRGPRX2-dependent pseudo-allergic/neurogenic route in human skin mast cells: functional programs, signal transduction, and regulation by cytokines

Abstract

Mast cells (MCs) are critical effector cells of cutaneous hypersensitivity reactions and inflammatory dermatoses alike. Apart from immunologic activation by aggregation of the high-affinity IgE receptor (FcεRI), MCs can be stimulated via a pseudo-allergic/neurogenic route. Antigen independent MC activation occurs mainly by ligation of the MAS-related G protein-coupled receptor-X2 (MRGPRX2). The recent discovery of MRGPRX2 explains multiple findings which could not be explained beforehand. Using MCs isolated directly from human skin, the major producer cells of MRGPRX2, the present study aims to fill in some gaps by exploring MRGPRX2-mediated activation, and to conduct a comparison with FceRI-triggered events. It was found that both receptor systems degranulate skin MCs and elicit similar cytokine patterns. Signaling intermediates provoked by both pathways included ERK1/2, p38 and AKT, while JNK- phosphorylation was weaker. In the kinetic resolution, phosphorylation events triggered by MRGPRX2 were swift, whereas FceRI triggered signals were delayed. ERK was the most influential kinase involved in cytokine synthesis with some contribution also from other kinases, while PI3K and ERK were both implicated in the degranulation response triggered by both pathways. MRGPRX2-mediated degranulation could be inhibited by pertussis toxin (PTx), YM-254890 and 2-Aminoethyl diphenylborinate (2-APB), which indicated Gi and Gq coupling as well as involvement of inositol- (1,4,5)-trisphosphate receptors (IP3R). Trying to connect the early events with downstream outcomes, it was found that p38, JNK and ERK1/2 depended on Gi, Gq, and IP3R, while AKT was only Gq-dependent. In addition to G protein activation, the b-arrestin pathway was also triggered by c48/80 leading to receptor internalization. By using RNA interference, b-arrestin-1 was detected as the dominant isoform in this scenario. MC modulating factors SCF, IL-4 and IL-33 were selected to study the impact from the micromilieu on MC functionality. SCF and IL-4 reversely regulated MRGPRX2 and FcεRI receptor expression and MC activation, whereby the MRGPRX2 pathway was dampened and the FcεRI pathway increased. IL-33’s modulation was time dependent but consistent between the two pathways: Long-term IL-33 decreased expression of both receptors and degranulation mediated by their ligands, while short-term IL-33 priming led to enhanced degranulation. Collectively, MRGPRX2- and FceRI-mediated routes are independent in terms of kinetics and regulation by extracellular stimuli, yet they also share similarities regarding functional outputs and the signaling intermediates underlying these outputs. Research regarding MRGPRX2 is still at its beginning, and a more comprehensive understanding of MRGPRX2 biology will provide a renewed understanding of MCs’ role in skin pathophysiology.

Mastzellen (MZ) stellen die wesentlichen Effektorzellen bei kutanen Hypersensibilitätsreaktionen und entzündlichen Hauerkrankungen dar. Über die immunologische Aktivierung durch Aggregation des hochaffinen IgE-Rezeptors (FcεRI) hinaus können MZ auch über eine pseudo-allergische/neurogene Route stimuliert werden. Diese Antigen-unabhängige MZ-Aktivierung erfolgt hauptsächlich durch Bindung spezifischer Liganden an den „MAS-related G protein-coupled receptor-X2“ (MRGPRX2). Seine jüngste Entdeckung erschließt zahlreiche Befunde, die zuvor unerklärlich waren. Unter Verwendung direkt aus der Haut isolierter Mastzellen, den Hauptproduzenten des MRGPRX2, zielt die vorliegende Studie darauf ab, einige der Lücken der MRGPRX2-vermittelten Aktivierung zu schließen, und einen direkten Vergleich zu den FceRI-induzierten Vorgängen zu ziehen. Dabei wurde ermittelt, dass beide Rezeptorsysteme Hautmastzellen degranulieren und auch ähnliche Zytokinmuster stimulieren können. Die Signalkomponenten, die über beide Wege aktiviert wurden, umfassten ERK1/2, p38 und AKT, während die JNK-Phosphorylierung schwächer ausfiel. In der kinetischen Auflösung ließ sich erkennen, dass MRGPRX2-induzierte Phosphorylierungsereignisse prompt auftraten, wohingegen FceRI-ausgelöste Signale verzögert waren. ERK stellte sich als die einflussreichste Kinase heraus, die maßgeblich in die Zytokinproduktion involviert war – mit zusätzlicher Unterstützung durch andere Kinasen –, während sowohl PI3K als auch ERK für die über beide Routen stimulierte Degranulation erforderlich waren. Die MRGPRX2-vermittelte Degranulation wurde zudem durch Pertussistoxin (PTx), YM-254890 and 2-Aminoethyldiphenylborinat (2-APB) inhibiert, was auf eine Kopplung an Gi und Gq ebenso wie auf die Beteiligung von Inositol-(1,4,5)- trisphosphat-Rezeptoren (IP3R) hinweist. Bei dem Versuch, die frühen mit den späteren Ereignissen zu verknüpfen, ließ sich zeigen, dass die Aktivierung von p38, JNK und ERK1/2 von Gi, Gq und IP3R gesteuert wird, während die AKT-Aktivierung einzig auf Gq beruht. Zusätzlich zur G-Protein- Aktivierung wurde auch der b-Arrestin-Weg durch den MRGPRX2-Liganden c48/80 angeschaltet, was die Internalisierung des Rezeptors zur Folge hatte. Die Verwendung von RNA-Interferenz konnte zeigen, dass b-Arrestin-1 die dominante Isoform in dem Szenario darstellt. Die MZ-modulierenden Faktoren SCF, IL-4 und IL-33 wurden gewählt, um den Einfluss des Mikromilieus auf die MZ- Funktionalität zu studieren. SCF und IL-4 regulierten die MRGPRX2- und FcεRI-Expression und - Aktivierung in umgekehrter Weise, wobei der MRGPRX2-Weg abgeschwächt, die FcεRI-Route hingegen verstärkt wurde. Die Modulation durch IL-33 war zeitabhängig, aber konsistent für beide Aktivierungswege: Eine Langzeitbehandlung mit IL-33 verminderte die Expression beider Rezeptoren und durch ihre Liganden vermittelte Degranulation, während ein kurzes „IL-33-Priming“ eine Erhöhung der Degranulation zur Folge hatte. Zusammengefasst stellen MRGPRX2 und FceRI unabhängige Systeme dar, wobei sich die ausgelösten Ereignisse in Bezug auf Kinetik und Regulation durch extrazelluläre Stimuli unterscheiden. Sie zeigen jedoch auch Ähnlichkeiten bezüglich funktioneller Outputs und der Signalkomponenten, die diesen Outputs zugrunde liegen. Die MRGPRX2-Forschung ist erst an ihrem Beginn, und ein besseres Verständnis der MRGPRX2-Biologie wird neue Einsichten in die pathophysiologische Rolle von MZ in der der Haut erbringen.