Proteinbiochemische Strukturanalysen der orthologen CLCA-Proteine eCLCA1 des Pferdes und mCLCA3 der Maus: Ein Beitrag zum Verständnis ihrer Funktionsweisen

Abstract

Die Mitglieder der CLCA-Familie stellen eine neu entdeckte Proteinfamilie dar, die funk-tionell mit einer Kalzium-aktivierten Chloridleitfähigkeit in verschiedenen Zelltypen im Zusammenhang steht. Die Vertreter mCLCA3 (Maus) und eCLCA1 (Pferd) spielen eine besondere Rolle bei Krankheiten mit gestörter sekretorischer Funktion. Insbesondere ihre Bedeutung bei der Becherzellmetaplasie, z.B. bei Asthma und chronischer-obstruktiver Bronchiolitis, ist von hoher biomedizinischer Relevanz. Funktionelle Analysen im hetero-logen Zellsystem zeigten in früheren Arbeiten, dass diese CLCA- Proteine eine der jener im Gewebe ähnlichen Chloridleitfähigkeit induzieren, die durch Kalzium als intrazellulärer Botenstoff gesteuert wird. Unklar war jedoch bisher, ob die CLCA-Proteine mit Hilfe von Transmembrandomänen einen eigenständigen Chloridkanal bilden oder ob sie Regulatoren eines anderen, bislang unbekannten Chloridkanals darstellen. Für die CLCA-Proteine wurde früher ein Protein-Strukturmodell mit vier oder fünf Transmembrandomänen erstellt. Ein solcherart strukturiertes Protein könnte die Funktion eines Kanals erfüllen. In neueren immunhistochemischen und elektronenimmunhistochemischen Untersuchungen konnte das mCLCA3-Protein jedoch in der extrazellulären Muzinschicht über den Enterozyten gefunden werden, so dass mCLCA3 offenbar durchaus zumindest zum Teil von der Zelle abgegeben werden kann. Diese Arbeit sollte die Fragestellung prüfen, ob mCLCA3 und eCLCA1 Transmembran-proteine darstellen und so möglicherweise echte Kanäle ausbilden können, oder aber ob sie sezernierte Proteine sind. Zur Klärung dieser Frage wurden umfangreiche computergestützte und proteinbiochemische Untersuchungen durchgeführt. Zuerst wurden mit Hilfe von unter-schiedlichen Computer-Algorithmen die Aminosäurensequenzen der Proteine nach möglichen Transmembrandomänen durchgemustert. Unter Anwendung der konfokalen Fluoreszenz-Mikroskopie wurde mCLCA3 in transfizierten Säugetierzellen intrazellulär in sekretorischen Vesikeln lokalisiert, eine Plasmamembranassoziation dagegen war nicht nachweisbar. Nach Expression von mCLCA3 in Säugerzelllinien wurde in pulse chase-Experimenten die Transportkinetik von mCLCA3 untersucht und mittels Westernblotanalyse wurde das Protein näher charakterisiert. Des Weiteren wurde das Glykosylierungsmuster der Proteine protein-biochemisch bestimmt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die für die CLCA-Proteine charakteristische Spaltung des Vorläuferproteins für mCLCA3 und eCLCA1 im endo-plasmatischen Retikulum stattfindet. Die mCLCA3- und eCLCA1-Spaltprodukte werden vollständig in den extrazellulären Raum als reife Glykoproteine sezerniert. Aufgrund des Fehlens von Transmembrandomänen können mCLCA3 und eCLCA1 daher keine eigenständigen Ionenkanäle bilden, somit kann eine echte Kanalfunktion für diese CLCA-Proteine ausgeschlossen werden. Als sekretorische Proteine sind sie aber offenbar durchaus in der Lage, indirekt eine Chloridleitfähigkeit zu induzieren. Außerdem könnten die CLCA-Proteine über eine Aktivierung von Signalwegen und regulatorischen Mechanismen die für Atemwegserkrankungen wie Asthma des Menschen und chronisch-obstruktive Bronchiolitis des Pferdes charakteristische Becherzellmetaplasie hervorrufen. Zukünftige Arbeiten sollten die Interaktionspartner und Funktionsmechanismen dieser CLCA-Proteine in Bezug auf die durch sie induzierte Chloridsekretion als auch auf die Becherzellmetaplasie und Muzin-synthese identifizieren.

Members of the CLCA-family represent an emerging protein family and are among the most promising molecular candidates for the calcium-activated chloride conductivity observed in several tissues. In particular, the murine mCLCA3 and the equine eCLCA1 have been identified as clinically relevant molecules in diseases with secretory dysfunctions. Their induction of goblet cell metaplasia in diseases like asthma and recurrent airway obstruction is of particular biomedical relevance. Functional analyses have indicated that these CLCA-proteins evoke a calcium-activated chloride conductance when heterologously expressed. However, it is not yet clear whether the CLCA proteins form chloride channels per se or function as mediators of other, yet unkown chloride channels. A four or five integral transmembrane model has initially been proposed for CLCA proteins. Such a protein structure could potentially form a transmembrane conductive pathway for anions. However, recent immunohistochemical and immune electron-microscopical analyses detected the mCLCA3-protein in the extracellular mucous layer, consistent with a secreted protein. This thesis was designed to address the issue of whether mCLCA3 und eCLCA1 are integral transmembrane proteins and act as real anion channels or wether they are secretory proteins. In this study, systematic computer-based und biochemical analyses were conducted. First, the amino acid sequences of the two proteins were screened for potential transmembrane domains using several computer algorithms. Subsequently, confocal microscopy on mCLCA3-transfected cells revealed that the mCLCA3-protein was intracellularly localized in secretory vesicles without any association with the plasma membrane. In addition, the intracellular trafficking was investigated by pulse chase experiments in transfected and metabolically labeled mammalian cells. The locations of the proteins were then characterized by westernblot analyses and the glycosylation patterns of the proteins were determined. The results show that the characteristic cleavage of the eCLCA1 und mCLCA3 precursor proteins takes place in the endoplasmic reticulum. Both cleavage products of the mCLCA3-protein are released as glycosylated, mature proteins into the extracellular space. This was similarly confirmed for the eCLCA1-protein. Thus, due to the lack of any transmembrane domains, these proteins are unable to form anion channels on their own. These results strongly suggest that eCLCA1 und mCLCA3 are secretory glycoproteins rather than transmembrane molecules. As such they could interact with other chloride channel proteins to induce the chloride conductivity observed in several previous experiments. Moreover, they could act as signalling molecules to evoke goblet cell metaplasia characteristic for complex airway diseases including asthma and recurrent airway obstructions. Future studies will have to address the interaction partners and the mechanisms responsible for their indirect induction of chloride secretion, goblet cell metaplasia and mucin secretion.