Untersuchungen zur Wirkung von Dexamethason auf CD3/CD28- stimulierte CD4+- T-Zellen unter Sauerstoffmangel (Hypoxie)

Abstract

Einleitung: Die Pathogenese der Rheumatoiden Arthritis (RA) ist charakterisiert durch das Synovium infiltrierende, aktivierte CD4+- T-Lymphozyten und das Vorkommen hypoxischer Areale. Die Hypoxie führt zur Stabilisierung des aus einer alpha- und beta- Untereinheit bestehenden Transkriptionsfaktors HIF-1, welcher über die Regulation seiner Zielgene T-Zell- Funktionen beeinflusst. Das Ziel dieser Arbeit war es herauszufinden, welche Interaktionen zwischen der Aktivierung, Dexamethason und Hypoxie bestehen. Methoden: Die Gewinnung von CD4+- T-Lymphozyten erfolgte aus dem Blut gesunder Spender. Die Zellen wurden für 20 Stunden unter Norm- bzw. Hypoxie inkubiert. Es wurde der Einfluss einer CD3/CD28- Aktivierung und unterschiedlicher Dosen Dexamethason bzw. des Steroidrezeptorantagonisten RU486 auf die mRNA- und Proteinexpression von HIF-1alpha und die mRNA- Expression der RA- relevanten HIF-1- Zielgene GAPDH, GLUT-1, MIF, PBEF und CXCR4 mittels Westernblot und Real- Time- PCR bestimmt. Weiterhin wurde der Einfluss von Hypoxie auf die Expression der Aktivierungsmarker CD25 und CD69 durchflusszytometrisch gemessen. Ergebnisse und Interpretation: Hypoxie führt in T-Zellen zur Stabilisierung von HIF-1alpha, welches die mRNA- Expression von RA- relevanten HIF-1- Zielgenen induziert. Die Aktivierung der T-Zellen führt zu einer deutlichen Steigerung der HIF-1alpha- Proteinexpression, bewirkt aber keine entsprechende Verstärkung der HIF-1- Zielgenexpression. Zugleich wird unter Hypoxie bei aktivierten T-Zellen eine signifikante Vermehrung des Anteils von RA- typischen, CD69+/CD25- T-Zellen beobachtet. Die vorliegenden Ergebnisse deuten darauf hin, dass Hypoxie nicht nur eine Begleiterscheinung von chronischen Entzündungen wie der RA darstellt, sondern besondere Relevanz für deren Pathogenese hat. Zur Behandlung der RA werden Glukokortikoide wie Dexamethason eingesetzt. In vitro bewirkt Dexamethason eine dosisabhängige Abschwächung der HIF-1alpha- Proteinexpression von aktivierten T-Lymphozyten ohne aber zu einer entsprechenden Reduktion der HIF-1- Zielgenexpression zu führen. Beim HIF-1 Zielgen CXCR4 bewirken Dexamethason und Hypoxie sogar eine synergistische Hochregulation der mRNA- Expression. Diese Ergebnisse zeigen, dass Dexamethason die Adaptationsprozesse von T-Lymphozyten an Hypoxie beeinflusst. In zukünftigen Medikamentenstudien sollte der Einflussfaktor Hypoxie deshalb berücksichtigt werden.

Introduction: The pathogenesis of rheumatoid arthritis (RA) is characterized by activated CD4+- T- Lymphocytes infiltrating the synovium and hypoxic areas in the inflamed tissue. Hypoxia leads to the stabilization of the transcription factor HIF-1, a heterodimer of an alpha- and beta- subunit. Through regulation of its target genes, HIF-1 modulates T-cell functions. The aim of this study was to examine adaptional processes of T-cells to hypoxic conditions in the RA- synovium and the influence of T-cell activation and the glucocorticoid dexamethasone. Methods: CD4+-T-cells were isolated from the blood of healthy donors. The cells were incubated for 20 hours in normoxic or hypoxic conditions. The impact of CD3/CD28-activition and different doses of dexamethasone or the steroid receptor antagonist RU486 on the transcript- and protein expression of HIF-1alpha and the transcript expression of the RA- relevant HIF-1 target genes GAPDH, GLUT-1, CXCR4, MIF and PBEF was measured using western blot and real-time PCR. The impact of hypoxia on the surface expression of activation markers CD25 and CD69 was measured by flow cytrometry. Results and discussion: Hypoxia leads to the stabilization of HIF- 1alpha and increases the transcript expression of HIF-1- target genes, relevant for RA. Activation induces an up-regulation of HIF-1alpha protein expression under hypoxia. However, HIF-1-target gene expression is not enhanced further in activated T-lymphocytes. In addition, the proportion of CD69+/CD25- T-cells typically found in RA patients is increased in activated T-cells under hypoxia. The experiments show that hypoxia is not simply side effect of chronic inflammatory diseases, such as RA, but instead is a relevant pathogenic factor. Glucocorticoids like dexamethasone are commenly used for treatment of RA- patients. In vitro, Dexamethasone leads to a dose-dependent abrogation of HIF-1alpha- protein expression of activated T-cells. However, this does not lead to an observable decrease in transcript expression of HIF-1 target genes. Moreover, dexamethasone leads to synergistic upregulation of the HIF-1 target gene CXCR4 in hypoxic T-cells. These results show that dexamethasone influences the adaptional processes of T-lymphocytes to hypoxia. Therefore, hypoxia should be taken into consideration in future pharmacological studies.