Background: Expression of the transcription factor Nkx2-1 is essential for forebrain, lung, and thyroid development in mice. Humans with NKX2-1 haploinsufficiency suffer from a rare condi-tion (“brain-lung-thyroid syndrome”) with various combinations of organ manifestations and no known genotype-phenotype correlation. There is typically a triad of choreoathetosis, infant respira-tory distress syndrome, and congenital hypothyroidism. Especially the neurological phenotype varies strongly between patients, and little is known about the impaired cell types. In recent years, cholinergic and parvalbumin-containing (PV) gamma-aminobutyric acid (GABA)ergic neurons of the basal ganglia and magnocellular nuclei of the basal forebrain (BF) have been found to maintain Nkx2-1 synthesis throughout life1,2, and their deletion to cause motor deficits and impairments of spatial memory and learning3. Cholinergic BF neurons are strongly influenced by the “nerve growth factor” (NGF), which is mainly synthesized by cortical GABAergic neurons4,5. They un-dergo shrinkage and degeneration without access to NGF6. To elucidate whether Nkx2-1 deficien-cy is accompanied by effects on the neurotrophin system, we investigate the expression levels of NGF, certain neurotrophin receptors, and the axonal sprouting marker growth-associated protein 43 (GAP-43) in conditional knockout mice with pre- or postnatal Nkx2-1 deletion. Additionally, a comprehensive literature review and genotype-phenotype correlation analysis of human cases is conducted to compare the results in mice. Methods: Expression levels of NGF, p75NTR, trkA, trkB, GAP-43, and the housekeeping genes HPRT and GAPDH were measured using quantitative real-time PCR. Therefore mice with prenatal mutation (GADcre/+;Nkx2-1c/c), postnatal mutation (ChATcre/+;Nkx2-1c/c) and corresponding con-trols were used (each n = 5). Moreover, the Cre-recombination in cholinergic neurons of the post-natal line was monitored using ROSA-26 reporter mice. The study was carried out according to institutional guidelines for animal welfare. Additionally, a literature review of human cases (1998 to May 2nd 2020) was performed and a disease severity score was developed and studied. Results: Significantly decreased expression levels of trkA (-82%) and p75NTR (-60%) in GAD67-mutants, and trkA (-56%) in ChAT-mutants were detected. The analysis of 351 human cases re-vealed a predominant neurological phenotype, an early lung-associated mortality, and certain geno-type-phenotype correlations. Conclusions: In summary the study demonstrates that: (1) the loss of cholinergic neurons after pre- and postnatal Nkx2-1 deletion is accompanied by a corresponding loss of trkA; (2) local axonal sprouting and cortical GABAergic NGF synthesis are not impaired; (3) similarly to mice, cognitive impairments play a role in humans; and (4) evidence for certain genotype-phenotype correlations exists for disease manifestations and severity.
Hintergrund: Die Expression des Transkriptionsfaktors Nkx2-1 ist essentiell für die Entwicklung des Vorderhirns, der Lungen und der Schilddrüse in Mäusen. Menschen mit NKX2-1-Haplo-insuffizienz leiden an einer seltenen Erkrankung („Gehirn-Lungen-Schilddrüsen-Syndrom“) mit verschiedenen Organmanifestationen und ohne bekannte Genotyp-Phänotyp-Korrelation. Typischerweise findet sich eine Symptomtrias aus Choreoathetose, Neugeborenen-Atemnotsyndrom und kongenitaler Hypothyreose. Insbesondere der neurologische Phänotyp unterscheidet sich stark zwischen den Patienten und es ist nur wenig bekannt über die betroffenen Neuronenpopulationen. In den letzten Jahren wurden im Mäusegehirn cholinerge und Parvalbumin(PV)-positive Gamma-Aminobuttersäure (GABA)erge Neurone der Basalganglien sowie des magnozellulären basalen Vorderhirns (BF) als Nkx2-1-positiv identifiziert und es wurde nachgewiesen, dass diese lebenslang Nkx2-1 exprimieren1,2 sowie, dass ihr Verlust im Gehirn zu motorischen Defiziten und Beeinträchtigungen des Lernens und des Gedächtnisses führt3. Cholinerge Neurone des BF werden stark vom „Nervenwachstumsfaktor“ (NGF) beeinflusst, der vor allem von GABAergen kortikalen Neuronen gebildet wird4,5. Sie schrumpfen und degenerieren ohne Zugang zu NGF6. Um herauszufinden, ob ein Nkx2-1-Defizit mit einer Beeinträchtigung des neurotrophen Systems einhergeht, haben wir die Expressionslevel von NGF und bestimmten Neurotrophinrezeptoren sowie dem axonalen Sproutingmarker Wachstumsassoziiertes Protein 43 (GAP-43) in konditionalen Mausmutanten mit prä- oder postnataler Nkx2-1-Deletion untersucht. Zusätzlich wurde eine ausführliche Literaturanalyse und Genotyp-Phänotyp-Korrelationsanalyse bei menschlichen Fallberichten durchgeführt, um die Ergebnisse in Mäusen zu vergleichen. Methoden: Die Expressionslevel von NGF, p75NTR, trkA, trkB, GAP-43 und der Housekeeping-Gene HPRT und GAPDH wurden mit quantitativer real-time-PCR gemessen. Für die Analyse wurden Mutanten mit pränataler Mutation (GADcre/+;Nkx2-1c/c) und postnataler Mutation (ChATcre/+;Nkx2-1c/c) sowie entsprechende Kontrollen (jeweils n = 5) verwendet. Zusätzlich wurde die Cre-Rekombination in cholinergen Neuronen der postnatalen Mauslinie unter Verwendung von ROSA-26-Reportermäusen überprüft. Die Experimente erfolgten gemäß den Tierschutzbestimmungen der Forschungsinstitution. Außerdem wurde eine Literaturanalyse menschlicher Fallberichte (1998 bis 2. Mai 2020) durchgeführt sowie ein Score für den Schweregrad der Erkran-kung entwickelt und untersucht. Ergebnisse: Eine signifikant reduzierte Expression ließ sich für trkA (-82%) und p75NTR (-60%) in GAD67-Mutanten und für trkA (-56%) in ChAT-Mutanten nachweisen. Die Analyse von 351 menschlichen Fallberichten zeigte einen vordergründig neurologischen Phänotyp, eine frühe lungenassoziierte Mortalität und gewisse Genotyp-Phänotyp-Korrelationen. Schlussfolgerungen: Zusammenfassend zeigt die Studie, dass (1) der Verlust cholinerger Neurone infolge prä- und postnataler Deletion von Nkx2-1 von einer Expressionsminderung von trkA begleitet wird, (2) lokales axonales Sprouting und die kortikale GABAerge NGF-Synthese nicht beeinträchtigt werden, (3) wie in Mäusen, kognitive Beeinträchtigungen auch bei Menschen eine Rolle spielen und (4) sich Beweise für das Vorhandensein gewisser Genotyp-Phänotyp-Korrelationen für die Krankheitsmanifestationen und den Schweregrad finden.
