Extracellular vesicles as cancer liquid biopsy biomarker

Abstract

Extracellular vesicles (EV) are nanosized cup-shape vesicles, harboring a complex molecular repertoire of lipids, nucleic acids and protein. They exhibit the ability to carry molecular information from parental to target cells, along with playing vital roles in tumorigenesis, growth, progression, metastasis and drug resistance. Alongside circulating tumor cells and circulating cell-free DNA, EV are emerging as an important liquid biopsy component due to their ability to not only mirrorinformation from cell of origin, but also the ability to protect their content in the circulation until arrival at the destination.

This thesis describes the isolation method of EV from cell lines, plasma and urine via differential centrifugation. Proteomic characterization was carried out with western blot, in which exosomal proteins, namely tetraspanins CD9 and CD81, were found to be enriched in the vesicles. Transmission electron microscope with anti-CD63 immunolabeling conjugated to 5 nm gold nanoparticles was used for the visualization of EV. Based on the defined criteria CD63-positive EV, varying from cup-shaped to round, 10-100 nm, with an intact membrane and central depression were identified.

KRAS, BRAF and ALK mutations from EV isolated from patients of colorectal cancer (CRC), melanoma (MM) and neuroblastoma (NB) were analyzed utilizing Droplet Digital PCR. EV-plasma samples collected post-therapy and tissue samples biopsied prior to treatment were compared, thus, allowing for the investigation of the vesicles’ potential to monitor treatment response and disease progression. Mutated cDNA species were identified in ten of thirty-five cases. Concordance rates with corresponding tissues were 54%, 44% and 25% in CRC, MM and NB cohorts, respectively.

Furthermore, two discordant cases were highlighted due to their interesting medical background. In regards to both cases, a mutation switch after anti-EGFR or BRAF/MEK inhibitor therapy was detected prior to disease progression validated via cancer staging or repeated tissue genotyping, providing a prognosis for a disease relapse.

In conclusion, we proved that extracellular vesicles are able to provide information on tumor heterogeneity and prognosticate progression. The oncology field is being revolutionizing and advancing in the direction of targeted therapy to provide patients with a more precise approach. Liquid biopsy is therefore a good accompaniment to tissue biopsy in assisting the future development of targeted therapy, which requires the possibility of repetitive real-time monitoring to understand the dynamic changes within the disease. EV-derived nucleic acids may provide clinically relevant diagnostic information and mirror the evolution of the disease.

Extrazelluläre Vesikel sind nanogroße, kelchförmige Vesikel mit komplexen molekularen Inhalten wie Lipiden, Nukleinsäuren und Proteinen. Sie können ihre molekularen Informationen von Mutterzellen an Zielzellen weitergeben und spielen daher eine wichtige Rolle bei Tumorentstehung, -wachstum und -progression, sowie beim Prozess der Metastasierung und dem Auftreten von Resistenzen gegen geläufige Therapiemethoden. Aufgrund ihres Vermögens nicht nur die Informationen von Mutterzellen widerzuspiegeln, sondern auch ihren molekularen Inhalt während des Transports durch die Blutzirkulation bis zur Ankunft am Zielort zu schützen, entwickeln sich EV neben zirkulierenden Tumorzellen und zell-freie DNA zu einer weiteren wichtigen Komponente der Liquid Biopsy.

Diese Dissertation beschreibt Methoden zur Isolierung von EV aus Zelllinien, Plasmen und Urin durch differentielle Zentrifugation. Die Charakterisierung der Proteine erfolgte durch Western Blots und ergab eine Anreicherung exosomaler Proteine (Tetraspanin CD9 und CD81) in den Vesikeln. Zur Visualisierung der Vesikel wurde ein Transmissionselektronenmikroskop mit anti-CD63 immunozytochemischer Markierung, konjugiert zu 5 nm Gold-Nanopartikeln, genutzt. Basierend auf definierten Kriterien wurden CD63 positive EV, mit variierender Form von rund bis kelchförmig, einer Größe von 10-100 nm, einer intakten Membran und zentraler Depression identifiziert. Die aus Proben von Patienten mit kolorektalem Karzinom, Melanom und Neuroblastom isolierten EV wurden mit Hilfe von Droplet Digital PCRs auf Mutationen in KRAS, BRAF und ALK untersucht. Vergleiche von posttherapeutischen EV-Plasmaproben mit prätherapeutischen Biopsieproben ermöglichten die Abschätzung des Potentials von EV als Faktor zur Überwachung des Therapieanschlagens und Krankheitsverlaufs.

In 10 von 35 Fällen konnte eine Mutation in der cDNA festgestellt werden. Die Konkordanzrate mit dem dazugehörigen Tumorgewebe in den jeweiligen Kohorten waren 54% für kolorektale Karzinome, 44% für Melanome und 25% Neuroblastome. Außerdem lassen sich zwei Fälle aufgrund ihrer Abweichungen und ihrem interessanten medizinischen Hintergrund hervorheben. In beiden Fällen konnte eine Änderung der Mutation nach einer Therapie mit EGFR- oder BRAF/MEK-Inhibitoren vor der Progressionsbestätigung durch Krebs-Staging oder wiederholtes Feststellen des Gewebe-Genotyps detektiert werden und ermöglichte somit ein Krankheitsrezidiv zu prognostizieren. Zusammenfassend gesagt, sind extrazelluläre Vesikel in der Lage Informationen über die Tumorheterogenität zu liefern, sowie eine Prognose über das Voranschreiten des Tumorwachstums zu ermöglichen.

Die onkologische Forschung bewegt sich in Richtung von personalisierten und patientenspezifischen Therapien. Dies erfordert die Möglichkeit einer wiederholbaren Echtzeitüberwachung der Krebserkrankung. Liquid Biopsy stellt daher einen guten und wichtigen Zusatz zur herkömmlichen Gewebebiopsie dar, um die dynamischen Veränderungen zu verstehen. Die in extrazellulären Vesikeln enthaltenen Nukleinsäuren können dabei klinische sowie diagnostische Information anbieten und folglich die Entwicklung der Krankheit widerspiegeln.