Organotypic head and neck cancer models for advanced preclinical drug testing

Abstract

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) reflect a highly heterogeneous and aggressive group of cancers for which concurrently many therapy options are associated with adverse side effects and resistance mechanisms. Although intense research is performed, the five-year survival rate is stagnating and remains low, with 50% on average. Preclinical drug testing is mainly based on animal testing, even though the gap between the species is known and the results are often misleading. Since tissue-engineered human-based models get more and more attention, due to their promising results in reflecting the human in vivo situation closely, models of normal oral mucosa (NOM) and tumor oral mucosa (TOM) have been developed in this thesis for advanced preclinical drug testing to improve HNSCC therapy. Hereby, NOM models reflected lining mucosa, with a defined basal membrane, the stratum basale, and stratum spinosum and primary tumor cells from patient-derived xenografts (PDX) and tumor cell lines could be integrated into the models by reflecting their original tumor grading-status. To elongate the model´s cultivation time, the commonly used collagen in the model´s matrix was replaced by a tight-knit web of esterified hyaluronic acid fibers, called Hyalograft 3D®. The development of the epithelium occurred slower but offered a continuous proliferation of up to 7 weeks in culture, in contrast to the 2 weeks limited functionality in the collagen-based models. This shows the high influence and importance of a well-defined extracellular matrix (ECM) for improved 3D-modeling. Drug effects have been investigated based on docetaxel and cetuximab, which are frequently used against head and neck squamous cell carcinoma, by comparing systemic and topical application routes. Docetaxel presented its potency by tumor mass reduction, with increased cell damage and inflammation as detected by lactate dehydrogenase and interleukin-6 release into the medium. Furthermore, a reduced proliferation (Ki-67), angiogenesis (HIF-1𝛼), and increased apoptosis (TUNEL) could be determined. Interestingly, the topical application often needed less docetaxel dosage to achieve the same cytostatic effects, compared to systemic application. In a first proof-of-concept study UHPLC-MS/MS analysis was integrated into the models, to enable automated sampling for docetaxel-concentrations inside the tumor tissue. Since sample preparations are dropped, this approach seems promising for future pharmacokinetic investigations. In contrast to docetaxel, cetuximab did not inhibit the proliferation of the tumor cells. Since cetuximab frequently triggers tumor resistances, it first had to be guaranteed, that the drug reaches its target site. Therefore, in cooperation with the physical institute of Freie Universität Berlin, the fluorescence-lifetime imaging microscopy and the atomic force microscopy-based infrared spectroscopy served for analysis. In summary, the established models could improve preclinical drug testing since the models closely reflect the human in vivo situation, are easily adaptable, and offer various drug-testings, be it based on morphology, pharmacokinetics, or drug detection. Future minimization of the models might allow high-throughput analysis and approaches for personalized medicine. Moreover, the integration of immune and blood cells could enable the study of a wider drug range and reflect the in vivo situation even more detailed. My developed and analyzed NOM and TOM models promise improved preclinical drug testing and promote the principles of 3R as the reduction, replacement, and refinement of animal testing.

Plattenepithelkarzinome im Kopf- und Halsbereich stellen eine sehr heterogene und aggressive Krebsart dar, bei der derzeitige Therapieoptionen mit starken Nebenwirkungen und Resistenzmechanismen assoziiert sind. Obwohl intensiv Forschung betrieben wird, stagniert die 5-Jahresüberlebensrate und verbleibt niedrig, mit 50% im Durchschnitt. Die präklinische Wirkstofftestung basiert hauptsächlich auf Tierversuchen, obwohl die Kluft zwischen den Spezies bekannt ist und die Ergebnisse meistens irreführend sind. Da die Züchtung von humanen Gewebsmodellen immer mehr Aufmerksamkeit erhält, auf Grund ihrer vielversprechenden Ergebnisse, die humane in vivo Situation nahe widerzuspiegeln, wurden Modelle der normalen Mundschleimhaut und von Tumormundschleimhaut in dieser Arbeit entwickelt um die präklinische Wirkstofftestung der Kopf- und Halstumortherapie zu verbessern. Hierbei bildeten die normalen Mundschleimhautodelle die auskleidende Mundschleimhaut mit einer definierten Basalmembran, dem Stratum basale und dem Stratum spinosum, ab. Primäre Tumorzellen aus Patienten-generierten Xenotransplantaten und Tumorzelllinien konnten in die Modelle integriert werden und deren ursprüngliche Tumor-klassifizierung wiederspiegeln. Zur Verlängerung der Kultivierungszeit wurde das gewöhnlich verwendete Kollagen in der Modellmatrix durch ein engmaschiges Gewebe aus veresterten Hyaluronsäurefasern, Hyalograft 3D® genannt, ersetzt. Die Ausbildung des Epithels erfolgte hierbei langsamer, gewährte aber eine kontinuierliche Proliferation über bis zu 7 Wochen in Kultur, im Gegensatz zu der auf 2 Wochen beschränkten Funktionalität von Kollagen-basierten Modellen. Dies zeigt den großen Einfluss und die Wichtigkeit einer gut definierten extrazellulären Matrix für verbesserte 3D-Modellierung. Wirkstoffeffekte wurden anhand von Docetaxel und Cetuximab untersucht, die häufig gegen Kopf- und Halskarzinomen eingesetzt werden, indem systemische und topische Applikationen miteinander verglichen wurden. Docetaxel zeigte seine Wirksamkeit durch eine reduzierte Tumormasse, mit erhöhtem Zelluntergang und Entzündungsreaktionen, die durch freigesetzte Laktat Dehydrogenase und Interleukin-6 im Medium detektiert wurden. Weiter konnte eine reduzierte Proliferation (Ki-67) und Angiogenese (HIF-1𝛼) und erhöhte Apoptose (TUNEL) Rate festgestellt werden. Interessanterweise wurde bei topischer Applikation oft eine geringere Dosis an Docetaxel benötigt, um dieselben zytostatischen Effekte zu erzielen wie bei systemischer Gabe. Um pharmakokinetische Untersuchungen an den Tumormundschleimhautmodellen zu ermöglichen, wurde weiter ein automatischer Probenzug für die UHPLC-MS/MS Analyse in die Modelle integriert und Docetaxel-Konzentrationen im Tumorgewebe über 5 Tage gemessen. Da Probenaufbereitungen entfielen, erscheint dieser Ansatz erfolgversprechend für zukünftige pharmakokinetische Untersuchungen. Anders als Docetaxel wirkte Cetuximab nicht proliferationsinhibierend auf die Tumorzellen. Da unter Cetuximab häufig Tumorresistenzen auftreten, musste zunächst gewährleistet werden, dass der Arzneistoff im Testmodell zur Zielstruktur gelangt. Hierfür dienten, die Fluoreszenzlebensdauer- Mikroskopie und Rasterkraftmikroskopie-gekoppelte Infrarotspektroskopie. Zusammenfassend könnten die etablierten Modelle die präklinische Wirkstofftestung verbessern, da sie die humane in vivo Situation nahe widerspiegeln, sie leicht adaptiert werden können und für unterschiedlichste Wirkstofftestungen verwendet werden können, sei es im Zuge der Morphologie, Pharmakokinetik oder Wirkstoffdetektion. Zukünftige Minimierung der Modelle könnte weiterhin Hochdurchsatzanalysen und Ansätze für personalisierte Medizin ermöglichen. Weiter könnte die Integrierung von Immun- und Blutzellen Untersuchungen von weiteren Wirkstoffklassen und eine noch detailliertere in vivo Situation Abbildung bewerkstelligen. Meine hier entwickelten normalen Mundschleimhaut und Tumor- Mundschleimhaut Modelle stellen vielversprechende präklinische Testmodelle dar, welche die 3R Prinzipien begünstigt, welche die Vermeidung, Verringerung und Verbesserung von Tierversuchen beinhaltet.