Eine gezielte Modifikation des menschlichen Genoms ermöglicht die Entwicklung von neuartigen Therapien für vererbte und erworbene Erkrankungen. Seit der Entdeckung des programmierbaren Nukleasesystems in Bakterien avanciert die CRISPR-Cas9 Technologie zum meist angewendeten System für die gezielte Genmodifikation. Für therapeutische Ansätze müssen Protokolle entwickelt werden, die eine effiziente und präzise Veränderung der Zellen ermöglichen. Zusätzlich sollte eine sorgfältige Evaluation möglicher Sicherheitsrisiken der Technologie durchgeführt werden, um eine Risiko-Nutzen-Analyse zur klinischen Anwendung anzufertigen. Die vorgelegten Arbeiten beschreiben eine neue virus-freie Methode zur Geneditierung mit CRISPR-Cas9. Elektroporation von CRISPR-Cas9 Ribonukleoproteinen ermöglicht eine hoch-effiziente Mutagenese von Genen in unterschiedlichen primären humanen hämatopoetischen Zellen bei geringer Toxizität. Das entwickelte Protokoll kann für unterschiedliche Zellarten adaptiert werden, die als schwer transfektierbar galten. Beispielsweise konnten primäre Leukämiezellen genetisch verändert werden, um Antigenverlust nach antigen-spezifischer Immuntherapie in vitro und mehreren Xenograft-Modellen zu simulieren. Die hohe Effizienz und geringe Toxizität erlauben die Adaption des Protokolls für klinische Anwendungen. Im Hinblick auf den Einsatz der Technologie im Menschen wurde die Immunogenität des am häufigsten genutzten Cas9 Proteins aus dem Bakterium Streptococcus pyogenes (SpCas9) untersucht. SpCas9-reaktive T-Zellen wurden in 95% der Erwachsenen detektiert. Angereicherte SpCas9-reaktive Effektor T-Zellen eliminierten SpCas9-überexprimierende Zielzellen in vitro. Zusammenfassend konnte eine Methode etabliert werden, um Gene in primären humanen Zellen – inklusive T-Zellen – hoch-effizient und spezifisch zu verändern. Die transiente Anwendung mittels Ribonukleoproteinkomplexen wurde als zusätzlicher Sicherheitsvorteil identifiziert, da die meisten Menschen über ein T-Zell-Gedächtnis mit Spezifität für Cas9 von Streptococcus pyogenes verfügen. Immunität könnte durch Kolonisierung und Infektionen durch fakultativ-pathogene Bakterien ausgelöst werden, aus denen das jeweilige CRISPR-Cas System hervorgeht. Die hohe Prävalenz von Cas9-spezifischen T-Zellen stellt ein vorher unerkanntes Sicherheitsheitsrisiko für die Anwendung von CRISPR-Cas9 in Menschen dar.
Targeted editing of the human genome enables the development of novel treatment options for inherited and acquired diseases. Since the discovery of the programmable nuclease system in bacteria, the CRISPR-Cas9 technology has become the most commonly used tool for gene editing. Therapeutic application of the technology in human patients requires the development of protocols for its effective delivery into the cells of interest with minimal toxicity as well as a careful safety evaluation. The works underlying this thesis describe a novel vector-free method for gene editing with CRISPR-Cas9. Electroporation of CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins was used to achieve targeted mutagenesis in primary hemopoietic cells with high efficiency and little toxicity. The established protocol can be adapted for many cell types that were previously thought to be hard to transfect. Exemplary, CRISPR-Cas was used to modify primary human leukemia cells in order to then simulate antigen-escape after antigen-directed immunotherapies in vitro and in various xenograft models. While high efficiency and minimal toxicity allow the adaption of the method for clinical applications, immunogenicity of Cas9 protein represents an unaddressed safety concern for its use in human patients. Therefore, T cell responses toward the most commonly used Cas9 nuclease protein from the bacterium Streptococcus pyogenes (SpCas9) were evaluated in healthy human adults. SpCas9-reactive T cells were detected in 95% of the healthy donors. Enriched SpCas9-reactive T cells lysed SpCas9-overexpressing target cells. In summary, a method was established to specifically mutagenize genes in primary hematopoietic cells at unprecedented efficacy. Furthermore, transient delivery of CRISPR-Cas9 components was identified as an additional safety advantage, because most healthy human adults exhibit preexisting T cell memory against SpCas9. Immunity to Cas9 proteins could occur by colonization or infections with the commensal or facultative-pathogenic bacterial species from which they originated. The high prevalence of pre-existing Cas9-specific T cells highlights a previously unrecognized risk for CRISPR-Cas9 applications in humans.
