Structure of functional complexes of the small ribosomal subunit

Abstract

The small ribosomal subunit is responsible for the decoding of the genetic information and plays a key role in the initiation of protein synthesis. To elucidate the mechanism of action of the ribosome and of the initiation process, we focused on the determination of the three dimensional structure by X-ray crystallography of the 30S subunit in complex with different short oligonucleotides complementing specific regions of the 16S rRNA, the initiation factor 3 and two antibiotics, edeine and tetracycline. We developed a new method to label the 30S subunit of T. thermophilus with oligonucleotides complementary to the 16S rRNA. In this way we could localise the 3' end of the 16S rRNA, which contains the anti-Shine-Dalgarno (anti-SD) sequence. We localised IF3-C at the solvent side of the platform, close to the anti-SD region of the 16S rRNA. The position of IF3-C shows clearly that the anti- association activity of IF3 is not due to the physical blockage of the inter- subunit interface, but it is rather the product of a change in the conformational dynamics of the subunit. We localised edeine in the vicinity of the E-site, interacting with universally conserved nucleotides in Helices 24 (H24), H28, H44 and H45. Our structure offers a good explanation as to why edeine blocks the path of the mRNA between the decoding region and the anti-SD region of the 16S rRNA in prokaryotes. We identified six tetracycline-binding sites on the 30S subunit (Tet-1 -Tet-6). Our data for the six positions of tetracycline can well explain the sometimes contradictory reported biochemical and functional data for tetracycline binding to the 30S subunits.

Für die Dekodierung der genetischen Information ist die kleine ribosomale Untereinheit zuständig, die eine Schlüsselrolle bei der Initiation der Proteinsynthese spielt. Um die Vorgänge im Ribosom und während des Initationsprozesses besser verstehen zu können, haben wir das Hauptaugenmerk unserer Untersuchung auf die Bestimmung der dreidimensionalen Struktur der 30S Untereinheit gelegt, die sich im Verbund mit verschiedenen Liganden befindet. Zu diesen Liganden gehören kurze Oligonukleotide, die bestimmte Regionen der 16S rRNA komplementieren, wie der Initiationsfaktor 3 und die Antibiotika Edein und Tetrazyklin. Die Lokalisierung der verschiedenen Liganden wurde mit Hilfe der kristallographischen Röntgenstrukturanalyse durchgeführt. Für unsere Untersuchung haben wir eine neue Methode entwickelt die 30S Untereinheit von T. thermophilus zu markieren. Der 16S rRNA werden komplementäre Oligonukleotide hinzugefügt. Auf diese Weise gelang es uns, das 3'-Ende der 16S rRNA zu lokalisieren, welches die Anti-Shine-Dalgarno (anti-SD) Sequenz enthält. Wir lokalisierten IF3-C auf der Außenseite der Plattform, nahe der anti-SD Region der 16S rRNA. Die Lage von IF3-C macht deutlich, daß die Anti- Assoziationsaktivität von IF3 nicht Folge einer physikalischen Blockierung der "inter-subunit interface" ist, sondern eher durch einen Wechsel in der Konformationsdynamik der Untereinheit hervorgerufen wurde. Wir lokalisierten Edein in der Nachbarschaft der E-Stelle. Es befindet sich in der Interaktion mit universell konservierten Nukleotiden der 16S rRNA in den Helices 24 (H24), H28, H44 und H45. Unser Strukturmodell liefert somit eine gute Erklärung, weshalb Edein den Weg der mRNA zwischen der Dekodierungsregion und der Anti- SD- Region der 16S rRNA in Prokaryonten blockieren kann. Wir identifizierten sechs Tetrazyklin-Bindestellen auf der 30S Untereinheit (Tet-1 bis Tet-6). Die von uns ermittelten Daten, zu den sechs verschiedenen Positionen von Tetrazyklin, erklären in einleuchtender Weise, wie es zu den oft widersprüchlichen Ergebnissen biochemischer und funktionaler Analysen des an die 30S Untereinheiten gebundenen Tetrazyklins kommen konnte.