Endogene Antisense-RNA als Regulationsfaktor für kardiale Gene

Abstract

Diese Habilitationsschrift stellt erstmals Antisense-RNA als Regulationsprinzip von drei kardialen Genen dar, nämlich für die a- und b-Isoform der schweren Myosinkette und das kardiale Troponin I. Ihre unterschiedliche Expression im Myokard der Ratte und des Menschen wurden ebenfalls erstmals dargestellt. Die Untersuchungen beschränkten sich nicht nur auf den Nachweis, sondern es konnten wesentliche Aspekte bezüglich ihrer Bedeutung geklärt werden. Ein mindernder Effekt auf die Proteinexpression konnte in-vitro für alle Antisense-Transkripte dargestellt werde. Die weitere Charakterisierung ergab neben Übereinstimmungen aber auch wichtige Unterschiede: Der Entstehungsort und -mechanismus sind offensichtlich nicht einheitlich. Während die Myosin-Antisense-RNA vom DNA-Gegenstrang transkribiert wird, ist für Troponin I eine Antisense-Transkription durch eine RNA abhängige Transkriptase im Zytoplasma wahrscheinlich. Darüber hinaus konnten Sense/Antisense-Hybridmoleküle von Troponin I nachgewiesen werden, welche als Folge der Duplex-Formation zwischen Sense und Antisense-RNA interpretiert werden. Die Ergebnisse stehen in Zusammenhang mit der jüngsten Entwicklung der RNA-Forschung. Diese weist der RNA eine viel bedeutsamere Rolle zu, als ihr bisher zugedacht war: Sie ist eben nicht nur das Material für Ribosomen und fungiert nicht nur als Botenstoff der DNA. Vielmehr spielt sie eine zentrale Rolle im Rahmen der Genexpression-Regulation und möglicherweise auch der RNA-Rekombination. Es ist davon auszugehen, dass natürliche Antisense-RNA für eine ganze Reihe weiterer kardialer Gene existiert. Die Untersuchungen sind geeignet, Antisense-RNA als Ziel therapeutischer Interventionen auch im Rahmen der Behandlung von Herzerkrankungen zu benennen.

This professional dissertation describes involvement of endogenous antisense RNA in gene regulation of three cardiac genes , such as a- and b-myosin heavy chain (MyHC) isogenes and troponin I (TnI). When investigating relative MyHC- isoform levels during ontogenesy in rats we observed a greater abundance of a-MyHC sense mRNA compared to protein levels in the early neonatal phase. We proposed posttranscriptional regulation might explain this non-coordinated expression, and we looked for naturally occuring antisense. Indeed, we were able to detect antisense RNA for a-MyHC and more detailed investigations revealed antisense transcription of both a-and b-MyHC isogenes. In addition for the first time - the existence of endogenous MHC antisense transcripts in the human heart was described. The potential effect of attenuating translation was shown in an in-vitro-translation-assay using artificial antisense- oligonucleotides with the sequence of naturally antisense RNA. Recent work by our group established the presence of antisense-orientated RNA transcripts of cardiac specific troponin I (cTNI) in rat and human myocardium. Interestingly, the different sizes of the rat and human antisense cTNI transcripts suggest species-specific reverse transcription initiation sites. Moreover, for the first time in cardiomyocytes, it was possible to demonstrate in vivo duplex formation between sense and antisense cardiac transcripts. A significantly higher ratio of antisense/sense cTNI RNA in neonatal compared to adult rats suggests a possible role of endogenous antisense cTNI in posttranscriptional regulation during development. Rapid amplification of cDNA ends (RACE) revealed a complete homology between the antisense RNA sequences and published cTnI mRNA sequence with no signs of intron-specific sequences or other sequence deviations. We hypothized that the antisense RNA must be transcribed from troponin I mRNA in the cytoplasm of the rat cardiomyocyte. It is apparent that although numerous examples of naturally occurring transcription have been reported to date, a general role for antisense RNA in the regulation of gene expression is not yet firmly established. Future research is required not only to document the existence of more examples of antisense expression, but also to carry out detailed studies to demonstrate gene regulation by antisense and possibly more importantly - regulation of antisense transcription. The increasing knowledge of endogenous antisense RNA will help us to better understand the mechanism of gene expression regulation in eukaryotes. In view of the growing evidence that antisense transcription is involved in human disease, it is reasonable to consider using antisense as a target for intervention procedures.