Each and any measurement method is tantamount to applying a filter to the world. Electrophysiology can detect action potentials and allows neuroanatomical reconstruction and identification of the measured neuron, if cells are filled after recordings. The method is, however, blind for the network that neurons are embedded in. Wide-filed imaging can visualize the activity of networks of neurons or whole neuropils, but lacks the spatial and temporal resolution necessary to identify single neurons. 2-photon microscopy promises to bridge the gap between those methods. To augment research on the olfactory system of the honeybee, I constructed a 2-photon laser scanning microscope (2PLSM) for imaging of neurons stained with the calcium-sensor FURA2. When the 2PLSM was finally operable, it proved to be capable of parallel measurements of calcium signals within multiple identifiable neurons simultaneously at a high temporal resolution. Recordings in single bees could last for hours, which is evidence for low phototoxicity. Anatomical image stacks with sufficient resolution for reconstructions of the cells were acquired in vivo in the 2PLSM. To demonstrate the potential of the method, I attempted to elucidate a hitherto unsolved, but much debated question: Why are there several projection neurons in each of the functional units of the primary olfactory brain center (glomeruli)? The incomplete convergence- divergence-connectivity between sensory neurons, antennal lobe neurons, and mushroom body neurons has inspired postulates about the functional relevance of the ~10 projection neurons that innervate each glomerulus. By recording from several projection neurons in parallel during odor-stimulations and during rest, hypothetical concepts become testable. Using a correlation-based measure of synchrony, it could be shown that projection neurons that are housed within the same glomerulus are indeed synchronized to a high degree, during odor-evoked activity as during rest. Determining synchrony was done separately for three signaling states that were automatically detected in all recordings: signals of excitation, signals of inhibition, and rest. Careful analysis of synchrony across signaling states revealed that synchrony of signals of excitation is higher during spontaneous signals as compared to signals that occurred during odor stimuli. Thus synchrony is result of the network of neurons in the antennal lobe, and not caused by input from sensory neurons. Synchrony was found to be strongest between sub-branches of a single neurons. Slightly weaker was the synchrony between branches of two distinct neurons housed in the same glomerulus. Surprisingly, synchrony and asynchrony were also found during resting phases in which recordings were void of detectable calcium signals. It could be shown that noise-like baseline fluctuations in a frequency band 19-38 Hz are essential for the detectability of the difference in synchrony between branches from the same vs. branches of different neurons in the same glomerulus.
Jeder Meßvorgang bedeutet eine Beschränkung auf das Meßbare; der größere Teil der Welt wird ausgeblendet. Mit der Methode der Elektrophysiologie können Aktionspotentiale in Nervenzellen gemesen werden, und die Zellen können in weiteren Schritten gefärbt, rekonstruiert, udn identifiziert werden. Die Methode ist jedoch blind gegenüber dem Netzwerk in dem die Nervenzellen eingebettet sind. Zeitaufgelöste Weitfeldfluoreszenzmikroskopie kann die Aktivität von ganzen Hirnregionen gleichzeitig visualisieren, aber die Raum- und Zeitauflösung ist zu gering um die Signale einzelner Nervenzellen darstellen zu können. 2-Photonen-Laser-Restermikroskopie verspricht, die Lücke zwischen diesen Meßmethoden, die in der Erforschung der Duftverarbeitung im Gehrin der Honigbiene weitlich angewandt wurden, zu schließen. Um die Erforschung der Duftverarbeitung im Gehirn der Honigbiene voranzubringen, habe ich ein 2-Photonen-Laser-Rastermikroskop für Messungen von mit dem Kalziumabhängigen Farbstoff FURA2 gefärbten Nervenzellen im Gehirn der Honigbiene aufgebaut. Das Mikroskop erwies sich als tauglich, zeitgleich und in hoher Zeitauflösung die Signale mehrerer Nervenzellen aufzunehmen. Messungen an einzelnen Bienen konnten über Stunden durchgeführt werden, was für eine geringe Phototoxizität der Belichtung spricht. In dreidimensional aufgelösten Bilderstapeln, die in lebenden Tieren aufgezeichnet wurden, wurde eine zur Rekonstruktion und Identifikation von mehreren Nervenzellen pro Präparat ausreichende Raumauflösung erreicht. Um das Potenzial der Methode auszuloten, habe ich eine vieldiskutiete Frage bearbeitet: Warum gibt es in jeder der 160 funktionelle Einheiten (Glomeruli) im Riechhirn der Honigbiene mehrere Ausgangsneurone? Die unvollständige Konvergenz-Divergenz-Verschaltung zwischen sensorischen Nervenzellen, Nervenzellen im Riechhirn, und Nervenzellen im Pilzlörper konnte mit den oben beschriebenen bisher genutzen Methoden nicht näher untersucht werden. Dennoch wurden in der Vergangenheit verschiedene Konzepte postuliert, die den ~10 Ausgangsneuronen, die jeden Glomerulus innervieren, funktionelle Relevanz beimessen. Durch die gleichzeitige Aufnahme der Nervenzellaktivität in mehreren Ausgangsneuronen mittels 2-Photonen-Laser-Rastermikroskopie werden die postulierten Konzepte testbar. Ein auf der Bestimmung von Korrelationskoeffizienten basierende Auswertungsmethode wurde angewandt, um das Maß der Synchronie zwischen Ausgangsneuronen zu bestimmen. Es konnte gezeigt werden, daß Ausgangsneurone innerhalb eines Glomerulus stark synchronisiert sind, und zwar nicht nur während duftevozierter Nervenzellsignale, sondern auch während Spontanaktivität. Synchronie wurde separat in drei Zuständen der Nervenzellen bestimmt, nämlich während Signalen von Erregung, Hemmung und während der Abwesenheit meßbarer Signale. Es zeigte sich, daß Signale von Nervenzellerregung während Spontanaktivität stärker synchronisier sind als Signale, die während der Duftstimulation auftraten. Also ist offenbar nicht der erregende Eingang von sensorischen Neuronen während Duftstimuli der synchronisierende Faktor, sondern Synchronie ist eine Eigenschaft des lokalen Nervenzellnnetzwerkes im Riechhirn. Die stärkeste Synchronie zeigte sich, wenn Zweige ein und des selben Neurons verglichen wurden. Etwas geringere Synchronie war zwischen Zweigen von unterschiedlichen Nervenzellen innerhalb des selben Glomerulus zu verzeichnen. Überaschenderweise konnten Synchrony und Asynchronie zwischen bestimmten Paaren von Nervenzellfortsätzen nicht nur während Phasen von Nervenzellerregung, sondern auch in Phasen von Hemmung und Ruhe festgestellt werden. Eine 19-38 Hz Komponente des Ruherauschens ist notwendig, um den Unterschied in der Synchronie zwischen Zweigen des selben gegenüber Zweigen von zwei verschiedenen Nervenzellen detektieren zu können.
