Investigations on Phase I Metabolism of Anabolic Androgenic Steroids and Its Influenceability as Tool to Refine Steroid Detection and Evaluation

Abstract

This thesis addresses the steroid metabolism and its role in the detection of steroids. The results were achieved by performing metabolic studies in combination with different analytical techniques. Three main outcomes were achieved. First, the generation of reference material for a long-term metabolite of the synthetic steroid Oral-Turinabol (OT) was presented. The obtained results enhance unambiguous detection and quantification of this metabolite and hence help to uncover the prohibited OT administration in sports doping. Second, structural requirements and tolerated functionalities for substrates of the enzyme Cytochrome P450 subtype 21A2 (CYP21A2) were evaluated. These insights help to extrapolate known metabolic reactions to new and potentially unknown compounds. Third, investigations on steroid profile changes caused by the intake of non-steroidal anti-inflammatory drugs were described. These findings provide knowledge on substances influencing steroid metabolism, which is of high relevance for accurate steroid determination and hence the correct interpretation of analytical results. All results were obtained using mainly three models to study steroid metabolism and its influenceability. First, incubations with Schizosaccharomyces pombe strains recombinantly expressing human CYPs were used to generate reference material in small amounts and to evaluate metabolic reactions. Second, incubations with isolated recombinantly expressed human enzymes were used to examine metabolic reactions and their influenceability by other drugs. Third, in vivo drug administration was used to study steroid metabolism in humans and to investigate whether the intake of non-steroidal anti-inflammatory drugs leads to changes in steroid concentrations and concentration ratios. To subsequently evaluate the samples generated by the methods described above different analytical techniques were utilized. High-resolution mass spectrometry (HRMS) was used for quantification and tentative structure identification. Liquid chromatography and gas chromatography were both combined with HRMS. Additionally, gas chromatography coupled to single or triple quadrupole mass spectrometry was employed to identify and accurately quantify compounds where reference material was already available. Finally, fluorometric measurements carried out in real time were used to determine kinetic characteristics of enzymatic reactions. The results presented in this thesis build a solid base for the refinement of steroid detection. It was shown that combinations of in vitro and in vivo metabolic studies and investigations on metabolic reactions together with adequate analytical techniques are of high relevance for the improvement of steroid detection methods. Furthermore, the results are of relevance to enhance methods for generation of reference compounds, to identify potentially new drugs and to re-evaluate the risk potential of drugs. Further areas that can benefit from the results of this work include clinical and toxicological analysis, analysis of environmental and biological samples and endocrinology. Finally, the results are of high importance for anti-doping analysis. This field shall be mentioned separately as the results presented particularly contribute to tackle challenges relevant in this research area.

Diese Arbeit befasst sich mit dem Steroidmetabolismus und dessen Rolle in der Steroidbestimmung. Die Ergebnisse wurden mit Hilfe von Stoffwechselstudien in Kombination mit unterschiedlichen analytischen Techniken erzielt. Drei Hauptergebnisse können formuliert werden. Ein erstes Ergebnis ist die Beschreibung der Erzeugung von Referenzmaterial eines Langzeitmetaboliten von Oral-Turinabol (OT). Die dabei gewonnenen Erkenntnisse vereinfachen den eindeutigen Nachweis und die Quantifizierung dieses Metaboliten und tragen somit dazu bei, die verbotene Einnahme von OT als Doping im Sport zu enthüllen. Weiterhin wurden strukturelle Voraussetzungen und tolerierte Funktionalitäten von Substraten des Enzyms Cytochrom P450 Subtyp 21A2 (CYP21A2) untersucht. Die daraus resultierenden Erkenntnisse ermöglichen die Extrapolation bekannter Stoffwechselreaktionen auf neue und möglicherweise unbekannte Verbindungen. Als drittes Hauptergebnis wurden Untersuchungen beschrieben, die sich mit Steroidprofilveränderungen befassen, die durch die Einnahme von Nichtsteroidalen Antirheumatika hervorgerufen werden. Dabei wurden Erkenntnisse gewonnen, die einen besseren Überblick über Substanzen, welche den Steroidstoffwechsel beeinflussen, ermöglichen. Dieses Wissen ist von großer Bedeutung für den eindeutigen Steroidnachweis und somit die korrekte Interpretation von Analysenergebnissen. Alle Ergebnisse wurden größtenteils durch die Verwendung von drei Modellen zur Untersuchung des Steroidstoffwechsels und seiner Beeinflussbarkeit generiert. Als erstes Modell wurden Schizosaccharomyces pombe Stämme genutzt, welche rekombinant humane CYP Enzyme exprimieren. Einerseits wurden sie verwendet, um Referenzsubstanzen in kleineren Mengen zu erzeugen, andererseits um Stoffwechselreaktionen zu bewerten. Als zweites Modell wurden Inkubationen mit isolierten rekombinanten humanen Enzymen durchgeführt, um Stoffwechselreaktionen und deren Beeinflussbarkeit durch andere Arzneistoffe zu untersuchen. Als drittes Modell wurden in vivo Arzneimittelanwendungen genutzt, um den Steroidstoffwechsel im Menschen zu untersuchen sowie die Auswirkungen der Einnahme von Nichtsteroidalen Antirheumatika auf Steroidkonzentrationen und -konzentrationsverhältnisse zu beleuchten. Um die durch die oben genannten Methoden erzeugten Proben anschließend zu analysieren, wurden verschiedene analytische Techniken verwendet. Hochauflösende Massenspektrometrie (HRMS) wurde zur Quantifizierung und vorläufigen Strukturaufklärung genutzt. Dabei wurden Flüssigchromatographie und Gaschromatographie gekoppelt mit HRMS angewendet. Zusätzlich wurde eine Kombination aus Gaschromatographie gekoppelt mit Single- oder Triple-Quadrupol Massenspektrometrie verwendet um Verbindungen, für welche Referenzmaterialien bereits verfügbar waren, nachzuweisen und exakt zu quantifizieren. Abschließend wurden fluorometrische Messungen in Echtzeit durchgeführt, um kinetische Kenndaten von Enzymreaktionen zu bestimmen. Die im Rahmen dieser Arbeit vorgestellten Erkenntnisse bilden eine zuverlässige Grundlage für die Verbesserung des Steroidnachweises. Es wurde gezeigt, dass eine Kombination aus in vitro und in vivo Stoffwechselstudien und Untersuchungen zu Stoffwechselreaktion in Verbindung mit geeigneten analytischen Techniken von hohem Stellenwert für die Verbesserung von Steroidnachweismethoden ist. Außerdem sind die Erkenntnisse von Bedeutung, um Methoden zur Erzeugung von Referenzmaterialien zu verbessern, potenzielle neue Arzneistoffe zu erkennen und das Risikopotenzial von Arzneistoffen neu zu evaluieren. Weitere Gebiete, die von den Erkenntnissen dieser Arbeit profitieren können, sind unter Anderem, die klinische und toxikologische Analytik, die Umweltanalytik, die Untersuchung von biologischen Proben und die Endokrinologie. Weiterhin sind die Ergebnisse von hoher Bedeutung für die Anti-Doping Analytik. Dieses Wissenschaftsfeld soll gesondert genannt werden, da die vorgestellten Ergebnisse dazu beitragen, Herausforderungen, die in diesem Gebiet von besonderer Relevanz sind, zu überwinden.