Hematopoiesis, the formation of blood cells, is probably the best understood system of cellular differentiation in mammalian biology. Traditionally, this process is thought to occur as a hierarchical progression of differentiation from hematopoietic stem cells (HSCs), where progressively lineage restricted oligo-, bi-, and unipotent progenitors are generated, eventually producing mature blood cells. However, this classical view is based on analyses performed in marker pre-defined bulk cell populations and has been challenged. Recent studies, enabled by single cell technologies, suggest that lineage commitment in hematopoiesis occurs much earlier than previously thought, at the hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) stage. It remains unclear what relevance these refined models of hematopoiesis have with regard to human diseases. Furthermore, while tremendous insight has been gained into this process on the transcriptional level, the contribution of post-transcriptional regulation in hematopoiesis remains to be largely explored. Here, we use an experiment of nature, the rare congenital disorder Diamond-Blackfan anemia (DBA), where the majority of mutations affect ribosomal proteins and the erythroid lineage is selectively perturbed, as a model to address these issues. We use human genetics to gain deeper insight into the ribosomal defects in DBA in vivo, biochemical and proteomic studies to examine ribosome levels and composition in human hematopoietic cells with DBA-associated molecular lesions, ribosome profiling in HSPCs undergoing erythroid lineage commitment to assess changes in translation globally, transcriptome analyses of hematopoietic master regulators from unperturbed human HSPCs, and intracellular flow cytometry analyses of primary DBA patient samples to elucidate the pathological mechanisms underlying DBA and how these relate to physiologic lineage commitment. We find that in DBA, the cellular levels of ribosomes are reduced, while the ribosome protein composition remains unaltered. This global reduction of ribosome levels impairs the translation of a select subset of transcripts including the key erythroid transcription factor GATA1. These transcripts have, among other properties, shorter and less structured 5’ UTRs than unaffected mRNAs, features that GATA1 exhibits relatively uniquely among hematopoietic master regulators, which may explain the erythroid lineage selective defect in DBA. Finally, we show that GATA1 protein levels are reduced already at the HSPC stage in primary DBA patients’ bone marrow specimens, which fits to the refined models of hematopoiesis that suggest lineage commitment takes place in this primitive cell compartment. By studying the rare congenital disorder DBA, we gain insight into how cellular ribosome levels and translation play a key role in the process of human hematopoietic lineage commitment.
Die Hämatopoese, die Bildung von Blutzellen, ist wahrscheinlich das am besten verstandene System der zellulären Differenzierung in der Biologie von Säugern. Traditionell nimmt man an, dass dieser Prozess als ein von hämatopoetischen Stammzellen (HSZ) ausgehendes, hierarchisches Fortschreiten der Zellliniendifferenzierung geschieht, wobei zunehmend Zelllinien-beschränkte oligo-, bi-, und unipotente Progenitorzellen generiert werden, die schließlich reife Blutzellen produzieren. Dieses klassische Konzept basiert jedoch auf Analysen, die in Marker prädefinierten Mischzellpopulationen durchgeführt wurden und wird nun in Frage gestellt. Neuere Studien, ermöglicht durch Einzelzelltechnologien, suggerieren, dass die Zelllinienspezifizierung früher als bisher gedacht, nämlich in hämatopoetischen Stamm- und Progenitorzellen (HSPZ) stattfindet. Welche Relevanz diese weiterentwickelten Modelle der Hämatopoese mit Hinblick auf humane Erkrankungen haben, ist unklar. Außerdem, während enorme Einblicke in diesen Prozess auf dem Transkriptionslevel gewonnen werden konnten, ist die Rolle der post-transkriptionellen Regulation in der Hämatopoese größtenteils unerforscht. Hier nutzen wir ein „Experiment der Natur“, die seltene kongenitale Erkrankung Diamond-Blackfan Anämie (DBA), welche in der Mehrheit der Fälle durch Mutationen in ribosomalen Proteinen verursacht wird und wobei die erythroide Zelllinienentwicklung selektiv gestört ist, als ein Modell um diese Aspekte zu adressieren. Wir nutzen humangenetische Untersuchungen um tiefere Einblicke in die ribosomalen Defekte in DBA in vivo zu erlangen, biochemische und proteomische Studien um die Ribosomenlevel und Ribosomenproteinkomposition in humanen hämatopoetischen Zellen mit DBA-assoziierten Molekularläsionen zu ermitteln, Ribosome Profiling in sich erythroider Differenzierung unterziehenden HSPZ um globale Änderungen in der Translation zu evaluieren, Transkriptomanalysen von hämatopoetischen Schlüsselregulatoren in nicht-pathologischen HSPZ und intrazelluläre Durchflusszytometrieanalysen von primären DBA Patientenproben um die der DBA zugrunde liegenden Pathomechanismen zu ergründen und diese in Bezug zur physiologischen Zelldifferenzierung zu stellen. Wir demonstrieren, dass die zellulären Ribosomenlevel in DBA reduziert sind, die Ribosomenproteinkomposition jedoch unverändert ist. Diese globale Reduktion der Ribosomenlevel beeinträchtigt die Translation einer bestimmten Untergruppe von Transkripten einschließlich des erythroiden Schlüssel-Transkriptionsfaktors GATA1. Diese Transkripte haben unter anderem kürzere und weniger strukturierte 5’ UTRs als unbeeinträchtigte mRNAs, Eigenschaften, die GATA1 vergleichsweise einzigartig unter hämatopoetischen Schlüsselregulatoren aufweist, was den die spezifisch erythroide Zellliniendifferenzierung betreffenden Defekt in DBA erklären könnte. Abschließend zeigen wir, dass die GATA1 Proteinlevel schon auf der Stufe der HSPZ in primären DBA-Patientenknochenmarksproben reduziert sind, was zu den weiterentwickelten Modellen der Hämatopoese passt, die suggerieren, dass die Zelllinienspezifizierung schon in diesem primitiven Zellkompartment stattfindet. Durch die Untersuchung der seltenen kongenitalen Erkrankung DBA erhalten wir Einblick darin, wie zelluläre Ribosomenlevel und Translation eine Schlüsselrolle in dem Prozess der humanen hämatopoetischen Zellliniendifferenzierung spielen.
