Optimisation of retroviral gene transfer in T lymphocytes for the redirection of PBL-specificity

Abstract

Adoptive T cell therapy is a promising approach for the treatment of cancer. Donor lymphocyte infusions in patients with cytomegalovirus-mediated disease, Epstein-Barr virus-positive B cell lymphomas, and chronic myelogenous leukaemia have proven the efficacy of transferred T cells to kill infected or malignant cells. The main hindrance of using this approach for the cure of other tumour entities is the often unsuccessful isolation and amplification of tumour-reactive T cells from patients. A potential method to circumvent this problem is the transfer of anti-tumour specificity to peripheral blood lymphocytes by retroviral T cell receptor (TCR) gene transfer. In this thesis I have compared several retroviral vectors regarding their gene transfer potential. For this purpose the green fluorescent protein (GFP) was cloned into vectors containing different cis-regulatory elements. Promoter and enhancer elements of two different long terminal repeats (LTR) and a cellular gene were compared. The LTR originating from the myeloproliferative sarcoma virus (MPSV) was shown to be superior to the Moloney murine leukaemia virus (MoMLV) LTR and a truncated MoMLV LTR/CD2 enhancer combination. Furthermore, the impact of a modified leader sequence and the Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element (PRE) was analysed. These elements showed an enhancing effect on transgene expression and retroviral titre, respectively. Taken together, the MP71 retrovirus containing the MPSV LTR, the modified leader, and the PRE demonstrated strong and durable transgene expression in murine and human T lymphocytes. High transduction rates were obtained when using retroviruses pseudotyped with an ecotropic MoMLV or the amphotropic 10A1 MLV envelope for murine or human cells, respectively. The same results were obtained after exchanging GFP with TCR α and β -chain genes, linked by an internal ribosomal entry site. The redirected primary human T lymphocytes showed the same specificity as the tumour infiltrating lymphocyte (TIL)-26 from which the TCR originated. Furthermore, the intensity of anti- tumour reactivity, measured as cytokine release and tumour cell lysis, was comparable for both the TCR-26-grafted T cells and the TIL-26. The TCR expression, analysed for a period of 100 days, remained stable. This approach enables us to generate functional renal cell carcinoma (RCC)-specific T lymphocytes by TCR gene transfer. These data provide the rationale for adoptive T cell therapy for RCC.

Der adoptive T-Zelltransfer ist eine viel versprechende Form der Tumortherapie. Die Infusion von Donor T-Lymphozyten für die Behandlung von Virusinfektionen (Cytomegalovirus und Epstein-Barr-Virus) und einigen wenigen Krebsarten hat sich als sehr effektiv erwiesen. Für die meisten Tumorarten ist jedoch die Isolierung und in vitro Vermehrung von Tumor-spezifischen T-Zellen nicht möglich. Eine Abhilfe für dieses Problem kann der Transfer von anti- Tumorspezifität schaffen, wie zum Beispiel der retrovirale Transfer von T-Zell Rezeptor (TCR)-Genen in periphere Blut-Lymphozyten (PBL). In dieser Arbeit habe ich verschiedene retrovirale Vektoren bezüglich ihrer Gentransfereffizienz in T-Lymphozyten analysiert. Dazu wurde das grün fluoreszierende Protein (GFP) in Vektoren mit verschiedenen cis- regulatorischen Elementen kloniert. Das Promotor/"Enhancer" Paar des "long terminal repeats" (LTR) des myeloproliferativen Sarkom-Virus (MPSV) war dabei dem Paar des LTR des Moloney-Maus-Leukämie-Virus (MoMLV) und einem Paar aus dem MoMLV Promotor und dem "Enhancer" des CD2-Gens überlegen. Der Einsatz einer modifizierten "leader"-Sequenz und des posttranskriptionellen regulatorischen Elements (PRE) des Waldmurmeltier-Hepatitis-B-Virus führte zu einer Erhöhung der Transgenexpression bzw. des Virustiters. Die Expressionsuntersuchungen ergaben, dass die Kombination aus der LTR des MPSV, der modifizierten "leader"-Sequenz und des PRE geeignet ist, um Gene in Maus- und humanen T-Zellen in hohem Maße und für längere Zeit zu exprimieren. Des weiteren wurde gezeigt, dass sich das ecotrope MoMLV, bzw. das amphotrope 10A1 -MLV-Hüllprotein, gut eignen, um Maus-, bzw. humane T-Zellen, zu transduzieren. Der Austausch des GFP durch TCR α und β -Ketten-Gene, verbunden durch eine interne Ribosomen-Eintrittsstelle, ergab ähnliche Expressionsergebnisse. Der transferierte TCR-26 wurde aus dem Nierenzellkarzinom-spezifischen Tumor-infiltrierenden Lymphozyten Klon-26 gewonnen. Die TCR-26-modifizierten T-Zellen zeigten dieselbe Spezifität wie der Ursprungsklon. Auch war die anti-Tumorreaktivität, gemessen als Zytokinfreisetzung und Zelllyse, der beiden Zellpopulationen vergleichbar. Die über einen Zeitraum von 100 Tagen analysierte TCR-Expression war stabil. Diese Ergebnisse zeigen, dass der Transfer von anti-Nierenzellkarzinomspezifität auf primäre T-Zellen möglich ist, und somit ein adoptiver T-Zelltransfer als Nierenzellkarzinomtherapie denkbar.