Struktur-Funktionsanalyse des Chemokins XCL1

Abstract

Einleitung Chemokine vermitteln die Interaktion von Immunzellen. Das Chemokin XCL1 wird von aktivierten CD8+ T-Zellen und NK-Zellen sezerniert und besitzt die für Chemokine typische Tertiärstruktur, bestehend aus einem N-Terminus, einem antiparallelen β-Faltblatt, einer α Helix und einem freien C-Terminus von etwa 20 Aminosäuren. XCR1 ist der einzige Rezeptor von XCL1 und wird ausschließlich auf kreuzpräsentierenden Dendritischen Zellen (DZ) exprimiert. Die selektive Expression des Rezeptors wird genutzt, um mit Hilfe von XCL1 Antigen in kreuzpräsentierende DZ einzubringen und so eine zytotoxische Immunität zu erzeugen. Ziel der vorliegenden Arbeit war eine umfassende Struktur-Funktionsanalyse des Chemokins XCL1, sowie die Untersuchung seiner Strukturvarianten hinsichtlich ihrer Fähigkeit, in vivo Antigen in DZ einzubringen.

Methodik Mit Ovalbumin (OVA) fusioniertes XCL1 wurde mit einer N-terminalen Deletionsvariante (Del-N7), zwei C-terminalen Deletionsvarianten (Del-C7, Del-C17), sowie einer XCL1-Variante verglichen, welche den C-Terminus einer homologen viralen XCL1-Sequenz (vCterm) aufwies. Die XCL1-Varianten wurden in Drosophila-Zellen exprimiert und in vitro hinsichtlich Rezeptorbindung, Chemotaxis und „Dekorierung“ toter Zellen untersucht. Des Weiteren wurden die XCL1-OVA Varianten auf ihre Fähigkeit zur Induktion einer Antigen-spezifischen CD8 T-Zell-Proliferation und -Zytotoxizität im Mausmodell untersucht.

Ergebnisse Der N-Terminus von XCL1 ist entscheidend an der XCR1-Rezeptorbindung beteiligt. Der native C-Terminus hat keine Bedeutung für die Rezeptoraffinität. Die chemotaktische Wirkung der XCL1-OVA Varianten entsprach ihrer Bindungsstärke an XCR1. Die stark verminderte chemotaktische Wirkung von Del-N7 ließ sich durch Konzentrationserhöhung voll kompensieren. Dies zeigt, dass der N-Terminus von XCL1 eine entscheidende Rolle bei der Stabilisierung der Rezeptor-Ligand-Interaktion hat, aber im Unterschied zu anderen Chemokinen nicht absolut notwendig ist für die Induktion der Chemotaxis. Die Bindung von XCL1 an tote oder nekrotische Zellen ist unabhängig vom N- und C-Terminus. Die XCL1-OVA Varianten wurden in vivo auf ihre Fähigkeit untersucht, spezifische T-Zell-Proliferation und -toxizität zu induzieren, was z.T. Rückschlüsse auf den Einfluss der XCL1-Domänen auf die Antigenprozessierung und -präsentation erlaubte. Varianten mit vergleichbarer Rezeptorbindung konnten ähnlich effektiv Antigen in DZ einbringen und CD8+ T Zellen aktivieren. Ein entscheidender Einfluss des C Terminus auf die Antigenprozessierung und -präsentation konnte ausgeschlossen werden.

Schlussfolgerungen Erstmalig wurde eine Struktur-Funktionsanalyse des Chemokins XCL1 mit natürlichen XCR1+ DZ in vitro durchgeführt. Insbesondere konnte die Bedeutung des N- und C-Terminus für die Funktion von XCL1 in vivo definiert werden. Somit können die inkonsistenten Ergebnisse bisheriger Studien über die funktionelle Bedeutung dieser Domänen von XCL1 neu bewertet werden. Die Studie leistet darüber hinaus einen Beitrag zur Entwicklung einer neuartigen therapeutischen Vakzine, bei der an XCL1 gekoppelte Antigene in vivo spezifisch in DZ eingebracht werden.

Introduction Chemokines facilitate the interaction of immune cells. The chemokine XCL1 is secreted by activated CD8+ T cells and NK cells. In terms of structure, XCL1 exhibits a typical short free N-terminus, three β-strands, an α-helix, and a free C-terminus of around 20 amino acids. XCR1, the only receptor for XCL1, is exclusively expressed on cross-presenting dendritic cells (DC). Because of this selective receptor expression, XCL1 is being used to target antigens into cross-presenting DC for induction of cytotoxic immunity. The present study was aimed to determine the structure-function relationship of XCL1 and the capacity of various structural variants to target protein cargo into DC in vivo.

Methods XCL1 fused to ovalbumin was compared to an N-terminal deletion variant (Del-N7), two C-terminal deletion variants (Del-C7, Del-C17), and a variant in which the C terminus was replaced by a homologous viral XCL1 sequence (vCterm). The XCL1 protein variants were expressed in Drosophila cells and analyzed in vitro for receptor binding, chemotaxis, and “decoration” of dead cells. Further, XCL1-OVA variants were tested for targeting of antigen into DC in vivo and thus for their capacity to induce CD8 T-cell proliferation and cytotoxicity.

Results The N-terminus of XCL1 strongly contributes to XCR1 receptor binding, whereas the C terminus is not involved. Chemotaxis data were fully congruent with binding studies. The reduced binding capacity and chemotaxis of Del-N7 could be fully compensated at higher concentrations. This result indicates that the N terminus of XCL1 has a major role in stabilizing receptor binding but, differing from other chemokines, is not critical for induction of chemotaxis. Neither the N- nor the C-terminal region of XCL1 contributed to binding of XCL1 to dead or necrotic cells. The effect of the XCL1-OVA variants on induction of T-cell proliferation was tested in mice. Variants with comparable binding capacity were comparably effective in antigen targeting into DC. A major effect of the C-terminal region of XCL1 on antigen processing and presentation could be excluded.

Conclusion This is the first structure-function analysis for XCL1 using natural XCR1+ cells for binding studies in vitro and functional studies in vivo. In particular, the contribution of the N- and C-terminus to the function of XCL1 in vivo could be determined. Former inconsistent results regarding the functional relevance of these XCL1 domains could be reevaluated. Moreover, this study contributes to the development of a new therapeutic vaccine employing XCL1 to target antigens into cross-presenting DC in vivo.