Der Zusammenbruch der Blut-Hirn-Schranke (BHS) spielt eine bedeutende Rolle beim Verständnis der sekundären Hirnschädigung nach Subarachnoidalblutung (SAB). Im proinflammatorischen Milieu nach SAB wird Interleukin (IL) 6 ein entscheidender Effekt auf das zerebrovaskuläre Leakage und die Bestandteile der Neurovaskulären Unit (NVU) zugeschrieben. Diese Arbeit charakterisiert neben Ausmaß und Ursachen der BHS-Schädigung den Einfluss des IL6 auf die BHS-Integrität in einem SAB-Mausmodell. Die SAB wurde in Wildtyp (WT) und IL6 Knock Out (KO) Mäusen mittels Filament-Perforations-Methode induziert. SAB und scheinoperierte SHAM-Tiere (Kontrollen) wurden an Tag 4 nach stattgehabter Blutung getötet. Die BHS-Permeabilität wurde anhand der Extravasation fluoreszierender Tracer, Evans Blue (EB, 70 kDa) und Fluorescein Isothiocyanate- (FITC)-Dextran (FD, 4 kDa), eruiert. Der Hirnwassergehalt wurde über das Verhältnis des Nass- zu Trockengewichts ermittelt. Die endotheliale Expression von Tight Junctions (TJ), Zytokinen (IL6, IL1β und Tumornekrosefaktor (TNF) α) und der Matrix-Metalloproteinase 9 (MMP9) wurde in isolierten Hirnkapillaren via qPCR untersucht. Die Verteilung von Collagen IV sowie apoptotische Desmin- und TUNEL-positive Perizyten wurden per Immunfluoreszenzmikroskopie ermittelt. An Tag 4 nach SAB wurde eine signifikante IL6-Überexpression (2,7 ± 0,5-fach) in WT beobachtet. Während FD in beiden Gruppen (WT und IL6 KO) in das Parenchym extravasierte, konnte eine SAB-induzierte EB-Extravasation lediglich bei WT beobachtet werden. Der Hirnwassergehalt lag bei WT nach SAB signifikant um 2,66 ± 0,47 % höher als bei IL6 KOs. Eine signifikante Rekonstitution der Occludin- (1,79 ± 0,14-fach der Expression der SHAM-Tiere), jedoch nicht der Claudin-5-Expression (0,86 ± 0,56-fach) konnte in SAB-operierten IL6 KO-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen beobachtet werden. Außerdem konnte eine Hochregulation von IL1β und TNFα in WT nach SAB festgestellt werden (je 2,3 ± 0,99-fach und 2,18 ± 0,77-fach der SHAM-Kontrollgruppe), wohingegen in IL6 KOs eine geringere Expression bestimmt wurde. Abschließend wurde eine höhere Anzahl apoptotischer Perizyten in SAB WT-Tieren im Vergleich mit der IL6 KO-Gruppe detektiert. Der Verlust der BHS-Integrität in WT-Mäusen nach SAB konnte anhand der EB-Extravasation sowie der verringerten TJ-Expression demonstriert werden. Die unterbundene EB-Passage, die partiell wiederhergestellte TJ-Expression und die weniger starke Beanspruchung von extrazellulärer Matrix sowie Endothel-Perizyten-Interaktion in IL6 KOs sind Indikatoren dafür, dass die BHS-Dichtigkeit in diesen Mäusen nach SAB besser erhalten wird. Der Einfluss des IL6 auf das zerebrovaskuläre Leakage sowie sein Effekt auf die NVU machen die zentrale Rolle dieses Zytokins bei der sekundären Hirnschädigung nach SAB deutlich.
Studying disruption of the blood-brain barrier (BBB) is central for the understanding of secondary brain injury after subarachnoid hemorrhage (SAH). Interleukin (IL) 6 has been postulated to affect cerebrovascular leakage and neurovascular unit components (NVU) under proinflammatory conditions following SAH. The presented work focuses on investigating the extent and causes of BBB breakdown, along with the influence of IL6 on BBB integrity in a SAH mouse model. Methods: Filament perforation model was used to induce SAH in wildtype (WT) and IL6 knock out (KO) mice. SAH- and SHAM-operated animals (controls) were sacrificed 4 days after the onset of the bleeding. By extravasation of fluorescents Evans Blue (EB, 70 kDa) and Fluorescein Isothiocyanate- (FITC)-Dextran (FD, 4 kDa) BBB permeability was assessed. Brain water content was determined applying the wet/dry weight method. Endothelial expressions of tight junctions (TJ), cytokines (IL6, IL1β, tumor-necrosis factor (TNF) α and matrix metalloproteinase 9 (MMP9) were analyzed in isolated brain capillaries by applying qPCR. Apoptotic desmin- and TUNEL-double-positive pericytes and the distribution of Collagen IV were assessed by conducting immunofluorescence microscopy. Results: On day 4 post-SAH, a significant IL6 overexpression (2.7 ± 0.5-fold) was detected in WTs. While FD extravasated in both groups, SAH-induced EB-extravasation was noticed only in WT mice. In comparison to IL6KOs, WT mice showed significantly higher brain water content after SAH (2.66 % ± 0.47 %). A significant reconstitution of occludin (1.79 ± 0.14-fold of SHAM) but not claudin-5 (0.86 ± 0.56-fold) was detected in SAHoperated IL6KOs compared to WTs. This study revealed IL1β and TNFα to be upregulated in WTs post SAH (2.3 ± 0.99-fold and 2.18 ± 0.77-fold of SHAM). This overexpression was attenuated in IL6KOs. Finally, degradation of extracellular matrix (ECM) and significantly more apoptotic pericytes were detected in SAH-WTs (3.1 ± 1.0- fold) compared to IL6KOs. Conclusion: The loss of BBB integrity in WT mice post SAH in terms of EB extravasation and lower TJ expression was demonstrated. Considering the constriction of EB extravasation, the partial reconstitution of TJ expression and the lower affection of ECM and endothelialpericyte interaction, we deduce that BBB tightness could be obtained more effectively in IL6KOs. Due to its proinflammatory influence on cerebrovascular leakage and its effect on NVU-components, we infer that IL6 is decisively involved in the presence of secondary brain injury post SAH.
