In this thesis, nanoparticle-based IAV inhibitors are developed via a combination of heteromultivalent structures and topography-matching nanoparticles. Firstly, the geometry-matching principle was studied by using nanoparticles with different spiky nanostructures on the surface. The topography of IAV virion was obtained from cryo-EM images, where a gap between HA and NA was noticed. With geometry modelling, it was revealed that compared with smooth surfaces, spiky surfaces were more favored for the virus interaction due to the increase of the interface area by spiky nanostructures. At a suitable spike length and spacing, the spikes could firmly insert into the gap of HA and NA, resulting in maximized area. Accordingly, the spiky nanoparticles were synthesized for the proof of concept and in a western-blot-based binding study. It was confirmed that nanoparticles with short spikes (approx. 10 nm in length and 10 nm spacing) were the best binders for IAV virions. The cryo-EM images further verified the insertion of spikes into the protein gap at this case. Even the spiky nanoparticles bound IAV virions, they were not considered to effective IAV inhibitors, due to that the binding was not strong enough to compete IAV-cell interaction. To obtain a potent inhibitor, the surface of spiky nanoparticles was further functionalized by RBCm to enhance the virus-inhibitor interaction. The RBCm coat nanoparticle bound strongly to IAV virion, hence blocking the IAV interaction with its host cells, which was confirmed by confocal laser scanning microscopy (CLSM) and flow cytometry. The cellular infection study of IAV showed a clear decease of infected cells with RBCm coated nanoparticle dispersed in the medium. As expected, the RBCm coated the nanoparticle with short spikes was the best inhibitor, showing > 90% reduction of infected cells. The inhibitor was also able to reduce the viral replication, for which 99.9% reduction of viral titers after 24 hours of infection. Being co-used with a small dose of an NA inhibitor, zanamivir, the reduction of viral titers after 24 hours achieved 99.99%, possible due to the enhancement of IAV-inhibitor interaction by zanamivir. In the second project, a potent IAV inhibitor was developed by combining spiky nanostructures with heteromultivalent surface functionalization. Two homo-multivalent polymeric structure, linear polyglycerol (LPG) functionalized 6’-silalylactose (LPG-SAL) and zanamivir (LPG-Zan) were synthesized and conjugated to the surface of nanoparticle with 10 nm spikes, the best viral binder from the first study, via click chemistry. After the functionalization, the inhibitor could engage HA and NA simultaneously for a robust binding, while the matched geometry to IAV increased the interaction area and further enhanced the virus-inhibitor binding. In the CLSM-based virus binding assays, it was noticed that the inhibitor almost abolished the virions on the cell surface and the cellular infection assays showed few-to-none infected cells in the presence of the inhibitor at a MOI of 0.1. Being used after the first cycle of infection, the inhibitor showed virus-inhibition activity with a 6 order of magnitude reduction of viral propagation. Even being used 24 hours after the first cycle of infection, a 5 order of magnitude reduction of viral propagation was also noticed, demonstrating the potency of the inhibitor. The inhibitor was also found to be active against three IAV strained circulated in human, A/X31 (H3N2), A/PR/8/34 (H1N1), and A/Panama/2007/1999 (H3N2), revealing its potential to be a broad-spectrum IAV’s inhibitor. It was noticed that the heteromultivalent inhibitor was much better than the homo-multivalent ones, which proves our hypothesis that heteromultivalency could further increase virus inhibition. In the final project, a new geometry-matching nanostructure towards IAV virion was studied, a nanobowl with concave morphology that could cap the surface of virion. A carbon-based nanobowl was synthesized and functionalized by RBCm and zanamivir. For the generation of heteromultivalent surface, zanamivir was grafted to DSPE-PEG2000, which could be inserted into the lipid bilayer of RBCm via hydrophobic interactions. In this project, we also revealed the broad-spectrum virus binding ability of RBCm, which could bind the virions of A/X31 (H3N2), A/PR/8/34 (H1N1), and A/Panama/2007/1999 (H3N2) at a binding constant in nanomolar range. By TIRF microscopy, we noticed that zanamivir significantly increased the virion binding to RBCm, with increased ‘on-rate.’ The virions were also found to stay on the heteromultivalent surface of RBCm and zanamivir for a longer time with more tracks than RBCm, revealing the zanamivir could help stabilize the virions. The stabilization of virions increased the virion binding. The inhibitor, nanobowl functionalized with RBCm and zanamivir showed robust inhibition towards IAV, revealed by virion binding studies and cellular infection assays. Due to the broad-spectrum IAV-binding ability, the inhibitor was found to the active against A/X31 (H3N2), A/PR/8/34 (H1N1), A/Panama/2007/1999 (H3N2) and a newly emerged A/Bayern/2009 (H1N1pdm).
In der vorliegenden Arbeit wurden nanopartikelbasierte IAV-Inhibitoren über eine Kombination von heteromultivalenten Strukturen und topografischer Anpassung entwickelt. Zunächst wurde das Prinzip der Geometrieanpassung durch die Verwendung von Nanopartikeln mit unterschiedlich stacheligen Nanostrukturen auf der Partikelobberfläche untersucht. Die Topografie von Influenza A Viruspartikeln wurde aus Kryo-EM-Bildern gewonnen, wobei Freiräume zwischen den Spikeproteinen HA und NA festgestellt wurden. Bei der Oberflächenanpassung von Nanopartikeln stellte sich heraus, dass stachelige Oberflächen im Vergleich zu glatten Oberflächen für eine Interaktion mit Virengünstiger waren. Vermutlich lässt sich diese Beobachtung auf eine größere Interaktionsfläche zwischen viralen Spikeproteinen und den Nanostacheln der Nanopartikel zurückführen. Anhand von Bindungsstudien und Westernblotanalysen konnte gezeigt werden, dass Nanopartikel mit kurzen Stacheln (ca. 10 nm Länge) und einem durchschnittlichen Stachelabstand von 10 nm die besten Bindungseigenschaften gegenüber IAV-Partikel aufwiesen. Kryo-EM-Aufnahmen stützten weiter die Bindung und Verzahnung von stacheligen Nanopartikel mit viralen Spikeproteinen. In zellbasierten Infektionsstudien konnten die stacheligen Nanopartikel jedoch keine effiziente IAV-Inhibition herbeiführen, weswegen weitere Optimierungsarbeiten notwendig waren. Erst über eine Oberflächenbeschichtung der Nanopartikel mit Erythrozytenmembranen (RBCm) konnte eine signifikante Virus-Nanopartikel-Interaktion in Zellbindungsstudienerzielt werden. Die Studie zur zellulären Infektion der IAV zeigte ein deutliches Absterben infizierter Zellen mit RBCm-beschichteten Nanopartikeln, die im Medium dispergiert waren. Wie erwartet, war das RBCm, das das Nanopartikel mit kurzen Spikes beschichtete, der beste Inhibitor und zeigte eine Reduktion der infizierten Zellen um > 90%. In Gegenwart von stacheligen und membranbeschichteten Nanopartikeln war eine virale Replikation 24 h nach Infektion drastisch reduziert (~99.9%). Bei gleichzeitiger Zugabe einer geringen Dosis des NA-Hemmers Zanamivir konnte der Titer sogar um 99,99% reduziert werden. In einem zweiten Projekt wurde ein wirksamer IAV-Inhibitor entwickelt, bei dem stachelige Nanostrukturen einer heteromultivalenten Oberflächenfunktionalisierung unterzogen wurden. Die beiden homo-multivalenten Polymerstrukturen, lineares Polyglycerin (LPG) funktionalisiert mit 6'-Sialyllactose (LPG-SAL) oder Zanamivir (LPG-Zan) wurden synthetisiert und mittels Click-Chemie an die Oberfläche stacheliger Nanopartikeln konjugiert. Durch diese Kombinationsstrategie soll die Virusbindung weiter verstärkt werden. In zellbasierten Infektionsstudien zeigte sich in Gegenwart dieser Inhibitoren eine stark reduzierte Infektion von Zellen. Bei Anwendung des Inhibitors nach dem ersten viralen Replikationszyklus zeigte der Inhibitor eine Reduktion der Virusvermehrung um 6 Größenordnungen. Selbst bei Anwendung 24 h nach dem ersten Replikationszyklus wurde eine Reduktion der Virusvermehrung um 5 Größenordnungen festgestellt, was die antivirale Wirksamkeit des Inhibitors untermauert. Es wurde auch festgestellt, dass der Inhibitor gegen drei beim Menschen zirkulierende IAV-Stämme (A/X31 (H3N2), A/PR/8/34 (H1N1) und A/Panama/2007/1999 (H3N2)) wirksam ist, was sein Potenzial als Breitband-IAV-Inhibitor offenbart. Es hat sich gezeigt, dass der heteromultivalente Inhibitor signifikant besser war als die homo-multivalenten Polyglycerole allein. Damit konnte unsere Hypothese, dass Heteromultivalenz die Virushemmung weiter erhöht bewiesen werden. In einem weiteren Projekt wurden neue, der sphärischen Virusgeometrie angepasste Nanostruktur gegen IAV untersucht. Nanoschalen mit konkaver Morphologie, die der Oberfläche von Viruspartikeln angepasst sind eigneten sich hervorragend für eine Virusbindung. Hierfür wurde eine Nanoschale auf Kohlenstoffbasis synthetisiert und mit RBCm und Zanamivir funktionalisiert. Zur Erzeugung einer heteromultivalenten Oberfläche wurde Zanamivir auf DSPE-PEG2000 in die Lipiddoppelschicht eines RBCm Mantels von Nanopartikeln eingebracht. In diesem Projekt deckten wir auch eine breitwirksame Bindungsfähigkeit von Viren an die mit RBCm beschichteten Nanoschalen auf. Für die Virustypen A/X31 (H3N2), A/PR/8/34 (H1N1) und A/Panama/2007/1999 (H3N2) konnten bis zu nanomolare Bindungskonstanten ermittelt werden. Mit Hilfe der TIRF-Mikroskopie stellten wir fest, dass Zanamivir die Virionen Bindung an RBCm signifikant erhöht, was auf eine erhöhte Bindungsrate ('On-Rate') zurückgeführt werden konnte. Es zeigte sich auch, dass die Virionen länger auf der heteromultivalenten Oberfläche von RBCm und Zanamivir mit höheren Anteilen an RBCm verblieben, was zeigt, dass das Zanamivir zur Stabilisierung der Virionen beitragen könnte. Der Inhibitor, eine mit RBCm und Zanamivir funktionalisierte Nanoschale, zeigte darüber hinaus eine eindrucksvolle Hemmung gegenüber IAV, was durch Virionenbindungsstudien und zelluläre Infektionstests nachgewiesen wurde. Aufgrund des breiten Spektrums der IAV-Bindungsfähigkeit wurde der Inhibitor als aktiv gegen A/X31 (H3N2), A/PR/8/34 (H1N1), A/Panama/2007/1999 (H3N2) und A/Bayern/2009 (H1N1pdm) gefunden.
