Einleitung: Der akute Myokardinfarkt gehört zu den weltweit führenden Todesursachen. Die Ischämie und therapeutische Reperfusion des Myokards kann durch Induktion einer Zytokinproduktion und Freisetzung Schädigungs-assoziierter Moleküle (DAMPs) zu einer sterilen Inflammationsreaktion führen. Therapeutische Hypothermie (TH) hat sich bereits zur Neuroprotektion etabliert und stellt, wie in vitro- und in vivo-Studien belegen, auch eine vielversprechende kardioprotektive Interventionsmöglichkeit dar. Die zellulären Mechanismen der TH sind jedoch noch unzureichend erforscht. In der vorliegenden Arbeit wurden daher sowohl der Effekt intraischämisch applizierter moderater TH (33,5 °C) auf die Zellviabilität primärer Kardiomyozyten während einer simulierten Ischämie (Oxygen-glucose-deprivation, OGD) und anschließenden Reperfusion (OGD/R), als auch die Initiierung der sterilen Inflammationsreaktion untersucht.
Methoden: Primäre murine Kardiomyozyten wurden einer 2-, 4- oder 6-stündigen OGD (0,2% O2, Mangelmedium ohne Glucose und Serum) ausgesetzt, gefolgt von einer 6-stündigen Reperfusion (21% O2, Vollmedium). Moderate TH (33,5 °C) wurde intraischämisch 1 Stunde nach Versuchsbeginn induziert und für den gesamten Versuch aufrechterhalten, während eine normotherme Versuchsgruppe bei 37 °C inkubiert wurde. Eine normoxische, normotherme Gruppe diente als Kontrolle. Der nekrotische Zelltod wurde anhand der LDH-Freisetzung in den Zellkulturüberstand quantifiziert, der apoptotische via Caspase-3-Aktivierung in Western-Blot-Analysen. Ebenso wurde die Genexpression der pro-inflammatorischen Zytokine IL-1ß, IL-6 und TNF-α, der iNOS als Mediator für oxidativen Stress, der anti-apoptotischen Kälteschockproteine RBM3 und CIRBP via quantitativer RT-PCR nach 6-stündiger OGD und 12 bzw. 24 Stunden Reperfusion untersucht. Die Freisetzung der DAMPs HMGB-1, CIRBP und Hsp70 in den Zellkulturüberstand wurde via Western-Blot bestimmt. In Vorversuchen wurden murine RAW 264.7-Makrophagen mit dem Zellkulturüberstand OGD/R-geschädigter Kardiomyozyten inkubiert und inflammatorische Marker via quantitativer RT-PCR analysiert.
Ergebnisse: Mit zunehmender OGD-Dauer ist ein Übergang von Apoptose zu Nekrose nachweisbar. TH reduziert beide Zelltodmechanismen signifikant. Die iNOS-Genexpression und die Freisetzung der untersuchten DAMPs nehmen korrelierend mit der Nekrose während der OGD-Phase zu und können durch TH verringert werden. Während der OGD/R ist die Genexpression weder von IL-1ß, IL-6 noch von TNF-α signifikant reguliert. In der Reperfusion steigt die Genexpression von RBM3 und CIRBP signifikant. Die Inkubation von RAW 264.7-Makrophagen mit dem Zellkulturüberstand OGD/R-geschädigter Kardiomyozyten zeigt in Vorversuchen keine Regulation inflammatorischer Marker.
Schlussfolgerungen: OGD/R-geschädigte primäre Kardiomyozyten können durch Freisetzung von DAMPs zur Initiierung einer sterilen Inflammationsreaktion beitragen. Moderate TH erhöht die Zellviabilität im Vergleich zur normothermen Versuchsgruppe, induziert anti-apoptotische Kälteschockproteine, verringert die DAMP-Freisetzung und ist somit ein vielversprechender Ansatz zur Kardioprotektion.
Objective: Acute myocardial infarction is one of the leading causes of death worldwide. Myocardial ischemia followed by therapeutic reperfusion can induce a sterile inflammatory response by enhancing cytokines production and the release of damage-associated molecular patterns (DAMPs). Therapeutic hypothermia (TH) has been established for neuroprotection and is, as suggested by in vitro and in vivo studies, a promising cardioprotective approach. However, the cellular mechanisms of TH remain to be elucidated. In this thesis, we investigated the effect of intra-ischemic moderate TH (33.5 °C) on primary cardiomyocytes viability during oxygen-glucose-deprivation (OGD) followed by simulated reperfusion (OGD/R) and the initiation of a sterile inflammatory response.
Methods: Primary murine cardiomyocytes were exposed to 2, 4, or 6 hours OGD (0.2% O2, medium without glucose and serum), followed by 6 hours reperfusion (21% O2, complete medium). Moderate TH (33.5 °C) was induced intra-OGD 1 hour after experimental start and maintained for the remaining duration of the experiment, while the normothermic group was incubated at 37 °C. A control group was maintained at normothermic and normoxic condition. Cell necrosis was assessed by LDH release and apoptosis by Western Blot for Caspase-3 activation. Gene expression of pro-inflammatory cytokines IL-1ß, IL-6, and TNF-α, mediator of oxidative stress iNOS, and anti-apoptotic cold shock proteins RBM3 and CIRBP were analyzed via quantitative RT-PCR after 6 hours OGD, 12 and 24 hours reperfusion. DAMP release of HMGB-1, CIRBP, and Hsp70 into the cultured supernatant was determined via Western Blot. Moreover, murine RAW 264.7 macrophages were incubated with the supernatant from OGD/R-damaged primary cardiomyocytes and inflammatory markers were analyzed by quantitative RT-PCR.
Results: Increasing durations of OGD lead to a switch in cell death mechanisms from apoptosis to necrosis, which are significantly attenuated by moderate TH. Correlating with necrosis, iNOS gene expression and the release of DAMPs increase during OGD and are reduced by TH. No significant differences in the regulation of IL-1ß, IL-6, or TNF-α during OGD/R were observed. However, RBM3 and CIRBP gene expressions are significantly increased by TH during reperfusion. Incubation of RAW 264.7 macrophages with supernatants from OGD/R-damaged primary cardiomyocytes does not result in any observable regulation of inflammatory markers in preliminary experiments.
Conclusion: OGD/R damaged primary cardiomyocytes can contribute to the sterile inflammatory response by releasing DAMPs. Moderate TH increases cell viability compared to normothermia, induces anti-apoptotic cold shock proteins expression, potentially attenuates the release of DAMPs, and is therefore a promising approach for cardioprotection.
