Bei der Betrachtung von „Exosome-like Nanopartikeln“ eröffnet sich zunächst die Frage: Was sind Exosomen? Als eine Klasse extrazellulärer Vesikel (EVs) gewannen sie in den vergangenen zwei Dekaden zunehmend an Bedeutung. Die Bildung und Freisetzung von EVs ist ein Prozess, der bei praktisch jedem Lebewesen und jeder Zelle aller Domänen stattfindet. Die physiologische Bedeutung von EVs wurde lange Zeit unterschätzt und bis heute nicht umfassend verstanden. Dass die Bildung und Sekretion auf verschiedenen, zum Teil redundanten Mechanismen basieren kann, deutet auf ihre enorme Wichtigkeit hin. Auch wenn die Fracht, insbesondere kleine nichtkodierende RNA (sRNA), eine zentrale Rolle für die Funktionalität der EVs spielt, so handelt sich doch um komplexe und hochfunktionale Gebilde, bei denen alle Komponenten aufeinander abgestimmt sind. Der Hülle kommen dabei offenbar ebenfalls zentrale Aufgaben zu, denn sie schützt nicht nur die teils fragile Fracht, sondern adressiert auch die Zielzelle, kann mit ihr interagieren und ermöglicht die Aufnahme.
Pflanzliche Exosome-like Nanopartikel wurden in praktisch allen Organen und Zellen – egal ob lebend, getrocknet oder im Labor kultiviert – gefunden. Es ist anzunehmen, dass sie vielfältige Funktionen erfüllen, darunter interzellularer Informationsaustausch im Sinne der Homöostase und Abwehr pathogener Mikroorganismen. Das verwendete Ausgangsmaterial bzw. die Isolationstechnik ist entscheidend für die Nomenklatur der Exosome-like Nanopartikel, denn wird das Pflanzengewebe homogenisiert, stammen diese „Nanovesikel“ nicht ausschließlich aus dem extrazellulären Raum. Ob und wie sich pflanzliche Nanovesikel von „echten“ EVs unterscheiden, ist und bleibt ungeklärt. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation konnten aus Calluskulturen EVs und Nanovesikel isoliert werden. Das schafft nicht nur eine wichtige Grundlage für zukünftige Untersuchungen, sondern auch für eine Produktion von pflanzlichen Nanovesikeln für den pharmazeutischen Einsatz unter gut definierbaren Bedingungen. Da gezeigt werden konnte, dass Nanovesikel die Trocknung von Pflanzenmaterial überstehen können, stellen pflanzliche Drogen ebenso eine mögliche Quelle für neue Vehikel zum Arzneistofftransport dar.
Aus einer Auswahl verschiedener Isolationsmethoden zeigte sich die differentielle Hochgeschwindigkeitszentrifugation für die Anreicherung der untersuchten Vesikel als besonders geeignet, obwohl sie mit weniger aufwändigen Techniken konkurrierte. Die morphologischen Eigenschaften der häufig zwischen 100 und 500 nm kleinen Strukturen wurden in der Regel am Transmissionselektronenmikroskop (TEM) begutachtet und von EVs aus Nicotiana tabacum L. zusätzlich am Kryo-TEM. Die Partikelgrößenbestimmung der pflanzlichen Nanovesikel war nur eingeschränkt möglich und die Aggregation der Vesikel machte eine zusätzliche Aufarbeitung notwendig, führte dann jedoch gemeinsam mit den elektronenmikroskopischen Aufnahmen zu einer nicht unrealistischen Einschätzung der Partikelgrößen und zu dem Schluss, dass jede Pflanzenspezies Vesikel individueller Größe produziert. Ebenso individuell waren die Ausbeuten an isolierten Vesikeln. Sie hingen sowohl von der Spezies, als auch vom verwendeten Ausgangsmaterial ab, wobei aus allen untersuchten Pflanzenteilen Nanovesikel isoliert werden konnten. Zur Einschätzung der Menge an isolierten Vesikeln diente die Proteinkonzentration als Surrogatparameter. Während der Membranfarbstoff 3,3'-Dihexyloxacarbocyaniniodid (DiOC6) die Ausbeute erhöhte, konnte er nicht zur Vesikelquantifizierung nutzbar gemacht werden.
Die Proteinanalytik von Nanovesikeln aus Drogen zeigte, dass das Proteom bei einigen (nicht allen) Drogen während der Trocknung erheblichen Veränderungen unterlag. Elektronenmikroskopisch konnten dennoch morphologisch intakte Vesikel beobachtet werden, was auf eine zentrale Rolle der Lipide für die Membranintegrität hindeutete. Die massenspektrometrische Identifizierung ausgewählter Proteine zeigte, dass zusätzlich zu der etablierten Isolation durch differentielle Zentrifugation weitere Reinigungsschritte notwendig sind. Es konnte nachgewiesen werden, dass sich die Agarose-Gelelektrophorese grundsätzlich für diesen Zweck einsetzen lässt und die Nanovesikel mithilfe von DiOC6 gleichzeitig im Gel visualisiert werden können, auch wenn die Effizienz bei der Rückgewinnung der Vesikel aus dem Agarosegel noch Optimierung bedarf.
Chromatographische Untersuchungen ergaben ein heterogenes Bild bezüglich des Vorkommens von Sekundärmetaboliten. Dass vorwiegend lipophile Substanzen in den Nanovesikeln angereichert waren, deutete darauf hin, dass diese von der Pflanze nicht aktiv in die Nanovesikel eingebracht worden sind. Mit der Etablierung eines HPTLC-Systems zur Analytik der Phospholipide wurden erste Schritte zur Aufklärung von deren Bedeutung für die Hülle der untersuchten Nanovesikel unternommen. Diese scheint für die intestinale Resorption eine wesentliche Rolle zu spielen. Obwohl erste Daten zeigten, dass pflanzliche Nanovesikel meist nur ein geringes inhibitorisches Potential gegenüber der Pankreaslipase aufwiesen, gelangen diese bei einer vielseitigen Ernährung in der Regel in Kombination mit potenten Inhibitoren verschiedener Verdauungsenzyme in das Duodenum. Damit ist es wahrscheinlich, dass ein relevanter Anteil der ingestierten Vesikel aus Nahrungsmitteln resorbiert werden und deren Fracht so ihre Wirkung auf den humanen Metabolismus entfalten kann.
Insgesamt handelt es sich bei Untersuchungen zur Charakterisierung und zu biologischen Wirkungen von Exosome-like Nanopartikeln pflanzlichen Ursprungs um ein vielschichtiges Gebiet mit dem Potential neue Ansätze für die Pharmakotherapie zu entwickeln, dessen Facettenreichtum noch einige offene Fragen bereithält.
The first question coming up, dealing with „exosome-like nanoparticles“ would appear: What are exosomes? As a class of extracellular vesicles (EVs), they attracted increasing attention during the past two decades. Formation and release of EVs is a process that apparently comes to pass in every living organism or cell of all domains of life. The physiological role of EVs has been underestimated for a long term and it has not yet been comprehensively understood. Formation and release of EVs is based on different, partially redundant mechanisms, indicating their great importance. Even though cargo, especially small noncoding RNA (sRNA), plays a key role in EVs´ functionality, these vesicles are highly complex structures with well-coordinated mixtures of bio-molecules. The envelope appears to be responsible for crucial tasks like protecting and addressing the cargo, interaction with and uptake to targeted cells.
Plant derived exosome-like nanoparticles have been found in practically every organ and cell – no matter if living, dried or lab-cultivated. It is assumed, that they accomplish a diverse set of tasks like inter-cellular information exchange in the manner of homeostasis and defense against pathogenic microorganisms. Nomenclature of exosome-like nanoparticles depends on the used raw material and isolation technique. If „nanovesicles“ are isolated from homogenates, they do not necessarily originate from extracellular space but if and how they are different from „genuine“ EVs remains puzzling. During the thesis project at hand, EVs and nanovesicles have been firstly isolated from callus cultures, building a sound foundation not only for further characterization but for the production of plant nanovesicles for pharmaceutical purposes under controlled conditions. Additionally, it has been proven that nanovesicles overcome the drying process of plant material. Herbal drugs can therefore stand as sources of vehicles for drug transport and targeting.
Among the repertory of possible isolation techniques, differential high performance centrifugation was especially suitable, although less laborious alternatives were available. Transmission electron microscopy (TEM) was the means of choice for assessing morphological properties of the usually 100 to 500 nm small structures. EVs from Nicotiana tabacum L. also have been visualized using a Kryo-TEM device. Although vesicle aggregates troubled particle size analysis, combining data with TEM results, realistic estimations revealed individual sizing of nanovesicles from different plant species. Likewise, yields of isolated vesicles were individual, depending on species as well as on raw material used. Thereby, nanovesicles could be isolated from all investigated plant organs. Protein concentration stood surrogate for vesicle amounts. 3,3'-Dihexyloxacarbocyaniniodid (DiOC6) could not be utilized to quantify vesicles, but helped increasing yields.
Proteomics of nanovesicles from herbal drugs demonstrated severe protein alteration in some, not all, dried plants. Nevertheless, TEM images displayed morphologically undamaged nanovesicles indicating a crucial role of lipids for the integrity of vesicle membranes. Mass spectrometric protein identification showed the necessity of further purification after differential centrifugation. Agarose gel electrophoresis can be exploited for this purpose and adding DiOC6 enables a simultaneous visualization of nanovesicles within the gel. Merely the efficiency of vesicle recovery needs some further improvement.
Chromatographic explorations revealed a heterogenic array regarding the occurrence of secondary metabolites. Since mainly lipophilic molecules were found to be enriched within the vesicle fraction, it appears plants do not actively package secondary metabolites into nanovesicles. With the establishment of a HPTLC procedure for phospholipid profiling, first steps towards the elucidation of the vesicle envelope´s importance have been made. The envelope is assumed to be essential for intestinal resorption. Although first data showed only slight inhibitory potential for plant derived nanovesicles on pancreatic lipase, in a diversified diet food-derived nanovesicles are usually taken up together with potent inhibitors of distinct digestive enzymes, making it likely that a relevant portion of the ingested vesicles may be absorbed and allow their cargo to impact human metabolism.
Conclusively, investigations on characterization and biological effects of exosome-like nanoparticles of plant origin comprise complex issues with the potential of developing new approaches for pharmacotherapy. This topic´s multifaceted nature holds ready a couple of unresolved questions.
