Abstract Background: The frequency of the protozoan Entamoeba gingivalis is strongly increased in inflamed periodontal pockets, where it contributes the second-most abundant rRNA after human rRNA. Another Entamoeba species, Entamoeba histolytica, colonizes the gut where it causes amoebic dysentery that often causes inflammation and ulceration of the colon. This raised our concern about a putative pathogenic role of Entamoeba gingivalis in oral inflammation and the pathogenesis of periodontitis. Aim: We aimed to evaluate the frequency of E. gingivalis in the oral cavity of periodontitis cases and healthy individuals. We assessed, if E. gingivalis used strategies to colonize the human host similarly to E. histolytica and compared the host adaptive immune response with the host response to colonization with the oral pathogenic bacterium Porphyromonas gingivalis. Method: Subgingival plaque and buccal swabs were collected for detection and culture of E. gingivalis. Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed after the DNA extraction of the collected samples with E. gingivalis specific primers. Primary gingival epithelial cells and fibroblasts were cultured from gingiva explants for the establishment of in vitro cell infection model. Quantitative real-time PCR was performed to test the related gene expression after the infection experiment. Histochemical staining was performed to prove the capability of E. gingivalis to invade inflamed human gingiva in vivo and in ex vivo biopsies. The cell proliferation rate of in vitro cultures of gingival epithelial cells was analyzed during E. gingivalis colonization. Results: E. gingivalis was detected in 15% of health controls (n=107), 77% of inflamed gingival pockets and 22% of healthy sites in periodontitis group (n = 51). MUC21 expression was upregulated in gingival epithelial cells after 2 h infection with E. gingivalis (7.7 fold, P=7×10-4). E. gingivalis infection of gingival epithelial and fibroblast cells increased IL-8 expression 2000 fold (P=2×10-4) and 20 fold (P=4×10-5), respectively. In gingival fibroblast cells E. gingivalis increased MMP13 expression 11 fold (P=3×10-4). In vitro infection further showed that E. v gingivalis inhibited cell proliferation, and induced cell death of gingival epithelial cells. Microscopy showed that E. gingivalis invaded the inflamed and wounded oral mucosa. Conclusion: E. gingivalis colonizes inflamed periodontal pockets in a high frequency and it has the capacity to invade inflamed and wounded gingival tissue where able to feed on the host cell nuclei. E. gingivalis infection causes a strong adaptive immune response, inhibits host cell proliferation and causes cell death. Upregulation of MUC21 and MMP13 suggests similar invasion strategies as the related colonic parasite E. histolytica.
Zusammenfassung Hintergrund: Das Protozoon Entamoeba gingivalis kolonisiert die Mundhöhle und ist besonders in entzündeten Parodontaltaschen sehr häufig. Hier trägt es nach menschlichen Zellen den größten Teil detektierbarer rRNA bei. Entamoeba histolytica, ein weiterer Vertreter der Gattung Entamoeba, kolonisiert den Darm und ist der Auslöser der Amöbenruhr, die oftmals durch Entzündung und Ulzeration des Darmgewebes gekennzeichnet ist. Ein möglicher Zusammenhang zwischen einer möglichen Pathogenität von Entamoeba gingivalis, oraler Entzündung und der Ätiologie der Parodontitis war zu Beginn der Arbeit nicht bekannt. Ziele der Arbeit: In der vorliegenden Arbeit sollte die Häufigkeit von E. gingivalis in der Mundhöhle von Patienten der Parodontitis und gesunden Probanden untersucht werden. Es sollte geprüft werden, ob die von E. gingivalis verwendeten Mechanismen zur Kolonisierung des menschlichen Wirtes denen von E. histolytica ähnlich sind. Außerdem sollte die adaptive Immunantwort gegen E. gingivalis gegen eine Infektion mit dem oralen pathogenen Bakterium Porphyromonas gingivalis verglichen werden. Methoden E. gingivalis wurde aus subgingivaler Plaque und Wangenabstrichen über einen DNA Nachweis mit der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) detektiert. Zur Etablierung eines in vitro Zellmodells zur Infektion mit E. gingivalis wurden primäre gingivale Epithelzellen und Fibroblasten aus Zahnfleischbiopsien kultiviert. Die relative Genexpression wurde durch Quantitative Real-Time PCR bestimmt. Gewebefärbungen wurden durchgeführt, um die Fähigkeit von E. gingivalis zu testen, in Zahnfleischgewebe einzudringen. Die Zellproliferation gingivaler Epithelzellen wurde während der in vitro Kolonisierung mit E. gingivalis bestimmt. Ergebnisse: E. gingivalis wurde in der Mundhöhle von 15% der gesunden Kontrollen nachgewiesen (N=107). 77% der entzündeten Zahnfleischtaschen und 22% der nicht-entzündeten Bereiche von Parodontitispatienten (N = 51) waren mit E. gingivalis kolonisiert. Infektion mit E. gingivalis erhöhte in gingivalen Epithelzellen signifikant die Expression des Gens MUC21 (7.7 fach) und IL-8 (1000 fach). In gingivalen Fibroblasten war die Expression von MMP13 durch E. gingivalis 11 fach erhöht. vii In vitro Infektion zeigte, dass direkter Zellkontakt mit E. gingivalis die Zellproliferation gingivaler Epithelzellen inhibiert und zu vorzeitiger Letalität führt. Gewebeschnitte zeigten, dass E. gingivalis in entzündetes und verwundetes Zahnfleisch eindringen, sich dort fortbewegen und ernähren kann. Schlußfolgerung: E. gingivalis ist ein häufiger Kolonisierer entzündeter Parodontaltaschen und hat die Fähigkeit in entzündetes und verwundetes Zahnfleischgewebe einzudringen, sich dort fortzubewegen und zu ernähren. E. gingivalis löst eine starke Reaktion des adaptiven Immunsystems aus, inhibiert die Zellproliferation und trägt zu vorzeitigem Zelltod bei. Die signifikant erhöhte Expression von IL-8, MUC21 und MMP13 deutet Wechselwirkungen an, die der Invasion- und Abwehrmechanismen zwischen menschlichem Wirt und E. histolytica ähnlich sind. Bei E. gingivalis handelt es sich um einen pathogenen Parasiten der Mundhöhle mit einer möglichen Bedeutung für die Ätiologie der Parodontitis.
