Genetische Modifikation von Neuronen, Glia- sowie Ventrikelependymzellen mit einem high capacity adenoviralen Vektor zur experimentellen Therapie von neurodegenerativen Erkrankungen des ZNS

Abstract

In der hier vorliegenden Arbeit werden unter Verwendung eines adenoviralen Vektors der dritten Generation, eines sogenannten gutless Vektors, zunächst die Transduktionseigenschaften sowie die Transduktionseffizienz verschiedener Stammzellpopulationen untersucht. Zu diesen Zellen gehören sowohl glial restringierte Vorläuferzellen der Ratte und des Menschen sowie embryonale Stammzellen der Maus. Stellvertretend für eine adulte Stammzelle wird die Möglichkeit einer Transduktion der autolog verfügbaren mesenchymalen Stammzellen aus dem humanen Knochenmarkstroma untersucht. Für die Transduktion werden Vektoren mit verschiedenen Reportersequenzen eingesetzt, sodass nach der Infektion der Transduktionserfolg anhand der Transgenexpression ermittelt werden kann. Zu den Reportergenen gehört einerseits das grün fluoreszierende Protein (GFP), das LacZ (ß- Galaktosidase) sowie als Markerenzym zur Darstellung der Syntheserate der transduzierten Zellen, die sezernierte alkalische Phosphatase des Menschen (SEAP). Unter Verwendung steigender infektiöser Partikel (10, 50 und 100 MOI) kann in den untersuchten Zellpopulationen eine dosisabhängige Transduktionsrate ermittelt werden. Dabei werden die höchsten Transduktionsraten in den glial restringierten neuralen Vorläuferzellen erzielt. Nach Infektion der neural differenzierten embryonalen Stammzellen zeigt sich ebenfalls die Tendenz einer bevorzugten Transduktion von glial differenzierten Zellen. Die Verwendung von adulten Stammzellen resultiert ebenfalls in Transduktionsraten von bis zu 85%. In einem weiteren Versuchsabschnitt werden glial restringierte neurale Vorläuferzellen nach Infektion mit dem adenoviralen Vektor in das Striatum adulter Ratten injiziert. Dieses Vorgehen soll die Möglichkeit eines ex-vivo gentherapeutischen Einsatzes in Verbindung mit astrozytären Zellen als mögliche Trägerzellen näher beleuchten. Die Befunde dieses Teilabschnittes zeigen, dass sich die transduzierten Zellen im Empfängergewebe integrieren und innerhalb des Beobachtungszeitraumes von 6 Wochen nur in begrenztem Maße in das umliegende Gewebe migrieren. Dabei zeigen die Zellen die normalen Differenzierungscharakteristika entlang der glialen Zelllinie, wie das für Astrozyten in-vivo beschrieben wurde. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Möglichkeit der direkten Vektorinjektion in das zentrale Nervensystem. Dabei wird der adenovirale Drittgenerationsvektor in verschiedene Hirnareale injiziert. Mittels immunhistochemischen Färbungen für NeuN und GFAP kann gezeigt werden, dass nach Injektion in das Striatum analog zur Situation in-vitro eine präferentielle Transduktion von Astrozyten erzielt wird. Innerhalb dieses Hirnkompartimentes kann eine Diffusion des Vektors bis zu einer Distanz von 1000 µm von der Injektionsstelle ermittelt werden. Nach Injektion der Vektorpartikel in das Corpus callosum kommt es zu einer Verteilung des Vektors innerhalb des gesamten Fasertraktes der weißen Substanz, einschließlich des kontralateralen Abschnittes. Mit diesen Befunden wird deutlich, dass die Verteilung des Vektors abhängig von der Struktur und Beschaffenheit des Empfängergewebes ist. Wird der Vektor in den Liquorraum des Seitenventrikels injiziert, kann anschließend eine Transgenexpression (GFP oder LacZ) in den Ependymzellen des gesamten Ventrikels dargestellt werden. Diese Befunde deuten darauf hin, dass sich der Vektor innerhalb des Liquor cerebrospinalis verteilt und als Folge eine generalisierte Transduktion der Ventrikelependymzellen erfolgt. Nach Anlegen einer permanenten Sonde in den Seitenventrikel kann kontinuierlich Liquor zur Analyse des Markerenzyms SEAP entnommen werden. Mittels des luminometrischen Nachweisverfahrens kann nach Vektorinjektion über einen Zeitraum von bis zu 42 Tagen das Enzym SEAP im Liquor cerebrospinalis nachgewiesen werden. Insgesamt zeigen die Befunde, dass die Verwendung des adenoviralen Vektors zumindest unter experimentellen Bedingungen eine zukunftsträchtige Therapieoption für Erkrankungen des zentralen Nervensystems darstellt.

In this study the characteristics of transduction as well as the efficacy of transduction of different stem cell populations are being investigated by using a 3rd generation adenoviral vector, a so called gutless adenoviral vector. These cells include glial restricted precursor cells of rat and human origin as well as murine embryonic stem cells. As representatives for an adult stem cell population the possibility of a transduction of the autologous available mesenchymal stem cells deriving from the human bone marrow stroma are examined. For cell transduction, vectors with different reporter sequences are applied, resulting in the possibility of measuring the transduction success after infection by the transgene expression. The reporter genes include the green fluorescent protein (GFP), the LacZ (ß-galactosidase) as well as the human secreted placenta alkaline phosphatase (SEAP). Applying increasing numbers of infectious particles (10, 50 and 100 MOI) a concentration-dependent transduction rate can be ascertained in the different investigated cell populations. The highest transduction rates are achieved in association with the glial restricted neural precursor cells. Following infection of the neural differentiated embryonic stem cells similarly a tendency towards a preferred transduction of glial differentiated cells is observed. The use of adult stem cells also results in transduction rates up to 85%. In further investigations glial restricted neural precursor cells, after having been infected with the adenoviral vector are injected into the striatum of adult rats. This procedure was performed in order to test the possibility of an ex-vivo gene therapeutical use in association with glial cells as possible carrier cells. The results show that the transduced cells are integrated into the receiving tissue and during the investigation period of six weeks only migrate into the surrounding tissue to a restricted extent. At a closer look the injected cells show normal characteristics of differentiation along the glial cell linage as it has been described for astrocytes in-vivo. The second part of this study focuses on the direct vector injection into the central nervous system. Therefore the 3rd generation adenoviral vector is injected into different brain areas. Using immunohistochemical investigations using antibodies against NeuN and GFAP it can be shown that after injection into the striatum analogous to the situation in-vitro a preferential transduction of astrocytes is achieved. Within this brain compartment a diffusion of the vector up to a distance of 1000 µm from the injection site can be determined. Following injection of vector particles into the corpus callosum, a vector distribution within the entire fibre tract of the white substance including the contralateral hemisphere is observed. With these results it can be shown that the allocation of the vector is dependent on the structure and features of the receiving tissue. Injecting the adenoviral vector into the cerebrospinal fluid results in transgene expression (GFP, LacZ and SEAP) in the ependymal cells surrounding the entire ventricle. These results suggest that the vector distributes within the cerebrospinal fluid and therefore would result in a generalized transduction of ependymal cells. After installing a permanent catheter in the lateral ventricle cerebrospinal fluid may be removed in a continuous manner in order to analyse/evaluate the marker enzyme SEAP. Using a luminometric screening procedure the enzyme SEAP can be demonstrated up to a period of 42 days following vector injection into the cerebrospinal fluid. Summarizing the results, the use of an adenoviral vector at least under experimental circumstances might be a pioneer therapeutical option for diseases of the central nervous system.