Funktionelle Charakterisierung regulatorischer Gene bei der Bildung der Wirbelsäule der Maus

Abstract

Die Embryogenese beruht auf einer Vielzahl von räumlich und zeitlich kontrollierten Prozessen, die aufeinander aufbauen. Ein wesentlicher Prozess bei der Bildung der Körperanlage und bei der Organogenese ist die Mesodermbildung. Sie beginnt mit der epithelialen mesenchymalen Transition (EMT), bei der epitheliale Zellen in mesenchymale Zellen umgestaltet werden, die dann in verschiedene Richtungen weiter differenzieren können. Darunter befindet sich das sogenannte präsomitische Mesoderm (PSM), aus dem die Somiten hervorgehen. Somiten sind u.a. die Vorläufer der Wirbelkörper und der Skelettmuskulatur. Embryonale Prozesse wie die Mesodermbildung werden durch noch nicht vollkommen aufgeklärte Netzwerke von Regulatorgenen gesteuert. Eine Charakterisierung des Zusammenspiels aller beteiligten Regulatorgene ist daher elementar für die Aufklärung von Vorgängen in der frühen Embryogenese, wie EMT und Mesodermbildung und würde zudem zum Verständnis von Vorgängen in der Tumorprogression und Metastasierung beitragen, da die EMT auch hierbei einen zentralen Vorgang darstellt. P19 Embryonale Carcinoma (P19 EC) Zellen dienten als Zellkulturmodell pluripotenter Stammzellen in vitro. Sie können in vitro zur Mesodermbildung induziert werden und damit zur Identifizierung von Regulatorgenen der Mesodermbildung verwendet werden. Die Charakterisierung der P19 EC Zellen mittels einer Antikörpermarkierung wies auf einen epithelialen Zelltyp mit Stammzelleigenschaften hin. Sie exprimierten die Markergene Cdh1 und Oct4, die epitheliale Zellcharakteristik und Pluripotenz anzeigen; eine Expression des mesenchymalen Markers Vim wurde im Gegensatz dazu nicht detektiert. Mittels Aktivierung der Wnt-Signalkaskade, die ein bei der EMT wichtiges Regelnetzwerk darstellt, sollte eine gezielte Induktion der P19 EC Zellen in Richtung Mesoderm ermöglicht werden. Alternativ sollte eine Differenzierung der P19 EC Zellen zu Mesoderm bzw. PSM mittels der Zugabe von DMSO oder einer Tbx6-Überexpression in den P19 EC Zellen untersucht werden. Mithilfe einer Microarray-Analyse sollte ein Gesamtüberblick über die sich dabei in ihrem Expressionsniveau verändernden Gene möglich werden. Durch Funktionsanalysen einzelner sich darin signifikant verändernder Gene wäre eine Eingliederung dieser Gene mit ihrer Funktion bei EMT und Somitogenese sowie im Embryo möglich. Eine gezielte Aktivierung der Wnt-Signalkaskade durch die Induktion mit Wnt3a oder SB216763, als Inhibitor von Gsk3β, einem wichtigen Enzym in der Wnt-Signalkaskade, war nicht möglich. P19 EC Zellen ließen sich demnach nicht mittels der Wnt-Signalkaskade zu einer Differenzierung en bloc in Richtung Rumpfmesoderm induzieren. Eine unspezifische Mesoderm-Induktion der P19 EC Zellen mit DMSO war dagegen möglich. Mittels Expressionsprofilierung auf einem Microarray konnten Mesoderm-spezifische Gene identifiziert werden. Der gleiche Effekt konnte allein durch Überexpression von Tbx6, einem essentiellen Regulator im PSM, erzielt werden. 24 Gene wurden bereits durch die alleinige Tbx6-Überexpression in den P19 EC Zellen beeinflusst. Aus diesen Genen wurden 12 auch durch die DMSO-Induktion allein reguliert. Die Überexpression des Transkriptionsfaktors Tbx6 in Kombination mit DMSO-Induktion begünstigte die Differenzierung der P19 EC Zellen in Richtung PSM. Tbx6 führte unter anderem zur Aktivierung der Regulatorgene Mixl1, Nrarp und Tnfrsf19, die für die weitere Funktionsanalyse mittels RNA- Interferenz ausgewählt wurden. Ein „knockdown“ der Expression in P19 EC- und in ES Zellen war aber mit den dafür hergestellten Konstrukten nur mit Tnfrsf19 erzielbar. In vivo im Embryo erzielte jedoch auch dieses knockdown-Konstrukt keinen Phänotyp. Weitere Funktionsanalysen mittels Überexpression von Tnfrsf19 und einer vermutlichen dominant negativen Variante dieses Gens in vivo zeigten ebenfalls keinen Phänotyp. Tnfrsf19 wurde sowohl als Zielgen des Wnt- Signalwegs als auch, in den eigenen Analysen aufgrund der Microarray-Daten, als Zielgen von Tbx6 identifiziert und scheint somit eine Rolle bei der Bildung von PSM zu spielen. Die vorliegende Arbeit erbrachte einen Hinweis auf eine Rolle von Tnfrsf19 bei der Bildung von PSM sowie der Somitogenese und identifizierte weitere Kontrollgene der EMT und Mesodermbildung im Mausembryo.

Embryogenesis is based on many locally and temporally controlled processes which are coordinated to each other. The formation of mesoderm is an essential process while forming the anlage of the bodyplan and during organogenesis. It starts with the epithelial mesenchymal transition (EMT) in which epithelial cells are transfigured to mesenchymal cells which are, then, able to differentiate into distinct directions. Among these mesenchymal cells the so called presomitic mesoderm (PSM) is situated, from which the somites emerge. Somites are the precursors of the vertebrae and the skeletal muscles. Embryonic processes such as mesoderm formation are controlled by signalling cascades of regulatory genes, which are yet not fully analyzed. The characterization of the interaction of all regulatory genes is therefore fundamental for the understanding of processes of early embryogenesis such as EMT and mesoderm formation. It also would help to understand processes during tumor progression and metastasis as EMT is also a pivotal event during these processes. P19 Embryonic Carcinoma (P19 EC) cells served as a cell culture model for pluripotent stem cells in vitro. They can be induced to formate mesoderm in vitro. They are, therefore, predestined to identify regulatory genes in mesoderm formation. The characterization of P19 EC cells using antibody staining furthermore indicates an epithelial cell type with stem cell features. The cells expressed the genes Cdh1 and Oct4 which are essential to identify epithelial cell characteristics and pluripotency. In contrast the cells didn`t express Vim, which is an essential gene to identify mesenchymal characteristics. Directed induction of P19 EC cells to differentiate to mesoderm should be possible by activation of the Wnt signalling cascade, which is an essential regulatory network of EMT. Alternatively differentiation of P19 EC cells to mesoderm or presomitic mesoderm should be analyzed while using DMSO or overexpression of Tbx6 in P19 EC cells. An overview of all genes changing their expression level should be analyzed via expression profiling on microarrays. Functional characterization of individual genes, which are significantly modified in their expression level, could help to integrate these genes and their function in EMT, somitogenesis as well as in the embryo. It was not impossible to induce directly the Wnt signalling cascade in P19 EC cells using Wnt3a or SB216763, an inhibitor of Gsk3β, an important enzyme of the Wnt signalling cascade. According to that there was no measured induction of the Wnt signalling cascade in P19 EC cells to differentiate en bloc into trunk mesoderm. It was possible to induce a non-specific mesoderm induction of P19 EC cells with DMSO. Mesoderm-specific genes were identified via expression profiling on microarrays. The same effect could be attained with exclusive overexpression of Tbx6, an essential regulatory gene within the PSM. 24 genes were influenced by the exclusive Tbx6-overexpression in P19 EC cells. 12 of those 24 genes were also regulated exclusively by DMSO-induction. Overexpressing the transcription factor Tbx6 in combination with DMSO was promoting the differentiation of P19 EC cells towards PSM. Among other things Tbx6 were activating the regulatory genes Mixl1, Nrarp and Tnfrsf19, whose functions were to be analyzed via RNA-interference. The only significant “knockdown” of the expression in P19 EC and ES cells with the established constructs was attained with Tnfrsf19. However, in vivo no embryonic phenotype was observed using this construct. Further functional analysis of overexpressing Tnfrsf19 and a probably dominant-negative isoform of this gene did likewise not show any phenotype. Tnfrsf19 as target gene of the Wnt- signaling cascade was also identified as target gene of Tbx6 in our analysis of the microarray data. Thus it seems to be relevant in the formation of PSM. The present thesis supplied indication on Tnfrsf19 being relevant in the formation of PSM and in somitogenesis and identified controlling genes of EMT and mesoderm formation in the mouse embryo.