Calcium Signalling during Primary Angiogenic Sprouting in Zebrafish

Abstract

Angiogenesis, the formation of new blood vessels from pre-existing ones, is a critical step for the formation of a functional vascular system during embryonic development. Furthermore, dysregulation of the vascular patterning is associated with more than 70 different diseases, including cancer, myocardial infarction, stroke and ocular disorders, such as macular degeneration. Studies of endothelial cells (ECs) in vitro and in vivo, have revealed the importance of vascular endothelial growth factor (VEGF) signalling together with the activation of the Dll4/Notch pathway to regulate EC’s differentiation into tip vs stalk cells as well as EC migration and proliferation during angiogenesis. Similarities between the endothelial tip cell and the axonal growth cone are well established. The two cell types share not only a similar anatomical structure, but also common molecular pathways and respond to the same molecular cues. Ca2+ signalling especially through the L-type Ca2+ channel (LTCC) is crucial to regulate the axonal turning in order to promote attraction or repulsion in response to a molecular cue. In ECs, increase in cytosolic Ca2+ concentration (Ca2+i) is a key regulator of migration, proliferation, contraction, gene expression and other biological aspects. Despite the similarities between neuronal and vascular systems, the role of Ca2+ signalling through the LTCC during vascular formation and angiogenesis is still poorly understood. This study provides evidence that the LTCC regulates EC migration during the primary angiogenic sprouting of the intersegmental vessels (ISV) in zebrafish embryos. The stimulation of the LTCC strongly increased EC migration from the dorsal aorta (DA), resulting in an overbranching phenotype, while the downregulation of the channel reduced the EC migration and proliferation compromising the ISV formation. Additionally, I observed that LTCC synergistically interacts with the canonical transient receptor potential-1 (TRPC1) Ca2+ channel to promote ISV development, suggesting the importance of Ca2+ fluxes through the plasma membrane during angiogenesis. Furthermore, mRNA-expression analysis of VEGF signalling and Dll4/Notch-pathway components revealed the importance of the LTCC during angiogenesis: perturbation of LTCC conductance, but not TRPC1, increased the mRNA-expression level of the VEGF and Dll4/Notch pathway components, compromising the angiogenic behaviour of ECs. Taken together, this study demonstrates that Ca2+ fluxes through plasma membrane of endothelial cells represent an integral part of angiogenic process. Moreover, like axon growth cone, the endothelial migration requires a tight regulation of Ca2+ signaling.

Die Angiogenese, die Entstehung neuer Blutgefäße aus vorbestehenden Blutgefäßen, stellt einen wichtigen Schritt bei der Formation eines funktionalen vaskulären Systems während der embryonalen Entwicklung dar. Fehlregulierungen bei der Entstehung des vaskulären Geflechts sind außerdem mit einer Vielzahl von Krankheiten, wie Krebs, Herzinfarkt und Schlaganfällen und Augenerkrankungen wie Makuladegeneration und mehr als 70 anderen Krankheiten assoziiert. Sowohl in vitro als auch in vivo Studien an Endothelzellen (EZ) zeigten einen wichtigen Einfluss des Vascular endothelial growth factor - (VEGF) Signalweges sowie der Aktivierung des Dll4/Notch-Signalweges auf die Regulierung der Differenzierung von EZ zu Spitzen- oder Stielzellen, auf die Migration von EZ sowie deren Proliferation während der Angiogenese. Gemeinsamkeiten zwischen der endothelialen Spitzenzelle und dem axonalen Wachstumskegel sind seit langem bekannt. Die beiden Zelltypen weisen nicht nur eine ähnliche anatomische Struktur, sondern auch gemeinsame molekulare Signalwege auf und reagieren auf dieselben Botenstoffe. Die Signaltransduktion durch Calciumionen, vorallem über den L-Typ Calciumkanal (LTCC), spielt eine wichtige Rolle bei der axonalen Wegfindung und beeinflusst entweder die Anziehung oder die Abstoßung der axonalen Zelle als Antwort auf Botenstoffe. In EZ ist ein Anstieg der zytosolischen Calcium-Konzentration (Ca2+i) unter anderem ein Schlüsselreiz für die Migration, Proliferation und Kontraktion der EZ sowie die Expression bestimmter Gene. Trotz der Gemeinsamkeiten zwischen dem neuronalen und vaskulären System, ist vor allem über die Rolle der Ca2+-Signaltransduktion über den LTCC bei der Formation des vaskulären Systems und der Angiogenese wenig bekannt. Die hier vorliegende Studie zeigt, dass der LTCC die Migration von EZ während der ersten angiogenetischen Aussprossung intersegmentaler Blutgefäße (ISV) in Zebrafisch-Embryonen reguliert. Eine Stimulation des LTCC führte zu einem starken Anstieg der Migration von EZ aus der dorsalen Aorta (DA) und resultierte in einer erhöhten Verzweigung entstehender Blutgefäße. Die Herunterregulation des Kanals reduzierte die Migration und Proliferation von EZ und führte zu einer Beeinträchtigung der Ausbildung von ISV. Des Weiteren konnte nachgewiesen werden, dass der LTCC bei der Entstehung von ISV synergistisch mit dem kanonischen transient receptor potential-1 (TRPC1) Ca2+-Kanal wechselwirkt, was die entscheidende Rolle des Ca2+-Fluxes durch die Plasmamembran während der Angiogenese beweist. Insgesamt zeigt die hier vorliegende Arbeit, dass Ca2+ - Ströme durch die Plasmamembran von Endothelzellen einen wichtigen Bestandteil des angiogenetischen Prozesses darstellen. Desweiteren ist für die Migration von Endothelzellen, wie beim axonalen Wachstumskegel, eine engmaschige Regulation von Calcium - Signalwegen vonnöten.