Computational analysis of circadian splicing events in human cancer cell lines and mammalian tissues

Abstract

The circadian clock regulates physiology and behavior of various organisms in synchrony with daily environmental rhythms. At the cellular level, circadian rhythmicity is driven by the interplay of clock genes and proteins that interact via negative feedback loops, thereby causing oscillations with a period of 24 h in the expression of numerous target genes. The resulting rhythms in the abundance of proteins and other biomolecules are responsible for the temporal organization of diverse biological processes. Accumulating evidence suggests that alternative splicing might be one of these clock-controlled processes. Alternative splicing describes a versatile mechanism of gene regulation that generates several distinct protein isoforms from a single gene via the differential inclusion or exclusion of alternate RNA regions. Both disruptions of the circadian clock and aberrant splicing are associated with carcinogenesis and tumor progression. This dissertation seeks to answer the question whether mammalian alternative splicing is regulated by the circadian clock, and whether the hypothesized regulation differs between cancer cells in different tumor stages. In particular, it tries to elucidate whether changes in circadian regulated splicing events could be responsible for the production of protein isoforms that contribute to the malignant development of cancer cells. The study is based on data from two human colon cancer cell lines, SW480 and SW620, that have been derived from a primary tumor and a metastasis of the same patient and thus serve as an in vitro model of colorectal tumor progression. A computational analysis was conducted to identify 24 h rhythmic genes and alternative splicing events on transcriptome-level based on the time-series data of both cell lines. As a reference, previously published time-series data of numerous healthy tissues from mouse and baboon organs were analyzed. The analysis revealed differences in the circadian phenotype of the two cell lines, with the metastasis-derived cell line SW620 exhibiting a stronger dysregulation of circadian rhythmicity. Furthermore, this work shows that splicing-related genes and putative splicing events display 24 h rhythms that differ between primary tumor- and metastasis-derived cells. Both in healthy tissues and cancer cells, rhythmic splicing was found to affect many genes that are themselves involved in splicing, suggesting a partial autoregulation of the process. Several of the spliced candidate genes encode for protein isoforms that are involved in processes promoting tumor progression, such as migration and angiogenesis. Taken together, the results presented in this dissertation point to a circadian regulation of alternative splicing that plays a role in cancer development.

Im Körper zahlreicher Organismen regelt eine innere Uhr den Ablauf physiologischer Prozesse im Einklang mit dem Tagesrhythmus der Umwelt. Auf zellulärer Ebene entsteht die sogenannte circadiane Rhythmik durch ein Zusammenspiel von Uhrgenen und -proteinen, welche durch negative Rückkopplungsschleifen miteinander interagieren und Oszillationen mit einer 24-Stunden-Periodik in der Expression zahlreicher Zielgene auslösen. Die hieraus resultierenden Rhythmen in der Verfügbarkeit von Proteinen und anderen biologischen Molekülen sind wiederum für die zeitliche Organisation einer Vielzahl biologischer Prozesse verantwortlich, darunter möglicherweise alternatives Spleißen. Alternatives Spleißen beschreibt einen Mechanismus der Genregulation, bei dem aus einem einzigen Gen durch variable Kombination von RNA-Teilabschnitten mehrere verschiedene Proteinvarianten mit zum Teil unterschiedlichen Eigenschaften erstellt werden können. Sowohl Störungen der circadianen Uhr als auch anomales Spleißen werden mit der Entstehung und Weiterentwicklung von Krebserkrankungen in Verbindung gebracht. Die vorliegende Dissertation geht der Frage nach, inwieweit eine circadiane Regulation von alternativem Spleißen in Säugerzellen vorliegt und ob diese sich für Krebszellen unterschiedlicher Tumorstadien unterscheiden. Im Besonderen wird die Hypothese untersucht, ob Veränderungen von circadian regulierten Spleiß-Ereignissen zur Produktion von Proteinvarianten führen könnten, die zur bösartigen Entwicklung von Krebszellen beitragen. Die der Arbeit zugrundeliegenden Daten stammen von zwei menschlichen Darmkrebszelllinien, SW480 und SW620, welche ursprünglich von einem Primärtumor und einer Metastase desselben Patienten etabliert wurden und als in vitro-Modell der kolorektalen Tumorprogression dienen. Basierend auf Zeitreihendaten der Genexpression in den beiden Zelllinien wurde eine computergestützte Analyse durchgeführt, bei der 24-Stunden-rhythmische Gene und alternative Spleiß-Ereignisse auf Transkriptomebene identifiziert wurden. Als Vergleichsbasis wurden bereits publizierte Zeitreihendaten zahlreicher gesunder Gewebesorten analysiert, die von Maus- und Pavianorganen stammen. Die Analyse offenbarte Unterschiede im circadianen Phänotyp zwischen den beiden Zelllinien, und eine stärker deregulierte circadiane Rhythmik der Metastasen-Zelllinie. Es konnte zudem gezeigt werden, dass am Spleißvorgang beteiligte Gene sowie mutmaßliche Spleißereignisse 24-Stunden-Rhythmen aufweisen, die sich ebenfalls zwischen den Krebsstadien unterscheiden. Sowohl in gesunden als auch in Krebszellen waren viele jener Gene rhythmisch gespleißt, die selbst am Spleißvorgang beteiligt sind, was auf eine Autoregulierung des Prozesses schließen lässt. Mehrere der gespleißten Kandidatengene codieren zudem für Proteinvarianten, die an Prozessen beteiligt sind, welche eine Weiterentwicklung des Tumors begünstigen, darunter Zellmigration und Angiogenese. Insgesamt legen die Beobachtungen eine circadiane Regulation von alternativem Spleißen in Säugerzellen nah, welche einen Einfluss auf die Krebsentwicklung hat.