"A good means to discovery is to take away certain parts of a system and to see how the rest behaves." - Georg Christoph Lichtenberg (1742-1799) Extensive studies using kinase inhibitors or overexpression of dominant negative mutants have demonstrated a pivotal role for class Ia phosphoinositide 3-kinase (PI3K) in carcinogenesis and glucose homeostasis as it regulates key cellular processes such as proliferation, survival, motility and glucose uptake. Class Ia PI3K is composed of a regulatory subunit, p85, and a catalytic subunit, p110. Various isoforms have been described for both subunits. The early embryonic death of mice deleted for PI3K catalytic isoforms (p110α-/- mice and p110β-/- mice) points to isoform specific functions since the remaining isoform cannot compensate for the deleted one. Furthermore, microinjection of inhibitory antibodies to the catalytic activity of PI3K has implied that mainly p110α mediates PDGF signals in vitro, while specifically the p110β isoform might transduce insulin signals. It is not clear how this specificity might be achieved. One possibility might be that specificity is derived from the PI3K regulatory isoforms. Here, I took a genetic approach to dissect specific functions of both the regulatory and catalytic isoforms of class Ia PI3K in vivo. To do so, I analyzed mice lacking PI3K regulatory or catalytic isoforms. We determined that only combined loss of p85α and p85β gene products (with or without intact expression of the smaller isoforms p55α and p50α) results in early embryonic lethality. We could see that in contrast to p110α and p110β which fulfill isoform specific functions during embryonic development, the PI3K regulatory isoforms p85α and p85β act in a redundant manner. The smaller isoforms p55α and p50α can partially compensate for the loss of 85kD isoforms. Interestingly, combined loss of p85α and p85β as well as p110α targeted disruption results in defects similar to those seen in PDGF receptor α -/- mice. Intact expression of p55α and p50α does not rescue the mice. We therefore conclude that during development PDGF receptor alpha transmits signals specifically through p110α/p85α or p110α/p85β complexes. Since mice deleted for all p85α and p85β gene products (p85α-/-p55α-/-p50α-/-p85β-/-mice) show defects similar to mice lacking PDGF receptor α, I established cell lines to further examine PI3K isoform specific functions in PDGF signalingin vitro. Results presented in chapter 3 show defects in PDGF induced lamellipodia formation and cell migration upon loss of the p85 subunit. Retroviral reintroduction of p85α, p85β or p50α restores the ruffling defect showing that the Rho-GAP domain, which is lacking in the small PI3K regulatory isoform p50α, is not necessary for PDGF induced lamellipodia formation. In addition, in chapter 4, I investigate whether loss of p110 catalytic subunits of PI3K causes a similar increase in insulin sensitivity to that seen in mice lacking p85 subunits. Since p110α\- or p110β-null mice are embryonic lethal, I analyzed mice with heterozygous loss of p110α and/or p110β. Interestingly, p110α+/-p110β+/- mice exhibit decreased p110 as well as p85 protein levels and a tendency to insulin resistance. Given that loss of any PI3K regulatory isoform results in hypersensitivity to insulin, my findings show that insulin signaling is controlled by a tight balance between the negative regulator, p85, and a positive regulator, p110.
Die Dissertation "In vivo role of class Ia PI3K regulatory subunit, p85" unter Anweisung von Prof. Dr. Lewis Cantley wurde in der Abteilung Zellbiologie der Harvard Medical School in Boston durchgefuehrt. Die Phosphoinositide 3-kinase (PI3K) spielt eine wichtige Rolle fuer die Wachstumsfaktor-induzierte Zellteilung, die Zellwanderung und die Aufnahme von Glukose aus dem Blut in die Zelle. Defekte in diesem Signaltransduktionsweg fuehren zur Entstehung von Krebs und Diabetes mellitus. Die PI3K ist eine Lipidkinase, die Phosphoinositole an der 3'-D Position ihres Inositolringes phosphoryliert. Dabei entsteht das Lipidprodukt Phosphoinositol-3,4,5-trisphosphat (PIP3). In transformierten Zellen werden haeufig erhoehte PIP3-Spiegel gefunden. In nicht-karzinogenen Zellen ist PIP3 nur nach Wachstumsfaktorstimulation (wie z.B. PDGF Zugabe) kurzweilig zu detektieren. PIP3 erfuellt die Funktion eines "second messengers", ein Botenstoff, der eine Kaskade von Aktivierungsprozessen ausloest, die unter anderem zu Zellteilung, Umstrukturierung des Aktinzytoskeletts, Zellwanderung und der Aufnahme von Glucose aus dem Blut in die Zelle fuehren. PI3K besteht aus einer katalytischen Untereinheit, p110 und einer regulatorischen Untereinheit, p85. Es existieren mehrere Isoformen fuer die katalytische (p110alpha, p110beta und p110delta) als auch fuer die regulatorische Untereinheit (p85alpha, p55alpha, p50alpha, p85beta und p55gamma). Die Rolle der PI3K wurde in bisherigen Experimenten mit Inhibitoren gegen diese Kinase oder PDGF-Rezeptormutanten, die PI3K nicht zu aktivieren vermoegen, untersucht. Diese Vorgehensweisen ermoeglichten es allerdings nicht, zwischen den spezifischen Rollen der einzelnen Isoformen von p110 und p85 zu unterscheiden. Die Herstellung von knock-out Maeusen, in denen die Expression jeweils einer Isoform oder auch mehrerer Isoformen ausgeschaltet ist, ergab wirkungsvolle Werkzeuge, mit denen die Funktion der PI3K Isoformen in vivo untersucht werden koennen. Die Gendeletion von entweder p110alpha oder p110beta fuehrt jeweils zu embryonalem Tod, was auf isoformspezifische Funktionen in vivo verweist. In dieser Dissertation zeigen wir, dass die Gendeletion von p110alpha und p85alpha/p85beta (p85alpha-/-p85beta-/- oder p85alpha-/-p55alpha-/-p50alpha-/-p85beta-/-) in der Maus zu den gleichen embryonalen Entwicklungsstoerungen fuehrt wie der Verlust von PDGF Rezeptor alpha. Die Expression von p110beta oder p55alpha/p50alpha koennen diese Entwicklungsstoerungen nicht verhindern. Dieses Resultat legt nahe, dass waehrend der Embryonalentwicklung die Signale des PDGF Rezeptor alphas von p110alpha/p85alpha und p110alpha/p85beta Komplexen weitergeleitet werden. Desweiteren wurden stabile Zelllinien etabliert, die weder p85alpha, p55alpha, p50alpha noch p85beta exprimieren. Diese embryonalen Fibroblasten weisen Defekte in mehreren PDGF-induzierten zellulaeren Prozessen auf und verweisen damit auf die Notwendigkeit von Klasse Ia PI3K in der Zellteilung, der Umstrukturierung des Aktinzytoskeletts, der Zellpolarisierung und der Zellwanderung. Die Interaktion zwischen Rac-GTP / Cdc42-GTP mit der Rho-GAP Domaene von p85alpha oder p85beta ist ueberraschenderweise nicht noetig fuer die PDGF- oder IGF-1-stimulierte Umstrukturierung des Aktinzytoskeletts, da auch die p50alpha Isoform, der diese Domaene fehlt, die Umstrukturierung des Aktinzytoskeletts vermitteln kann. Genverlust der PI3K regulatorischen Untereinheit (p85alpha-/-) oder kombiniert heterozygoter Verlust von p110alpha und p110beta (p110alpha+/-p110beta+/-) fuehren jeweils zu bedeutendem Verlust von PI3K Aktivitaet und derjenigen PI3K Aktivitaet, die nach Insulinstimulation mit IRS Proteinen assoziert. Dennoch, sind die jeweiligen Effekte dieser Gendeletionen auf den Glukosetransport entgegengesetzt: Verlust von p85alpha fuehrt zur gesteigerten Insulinsensitivitaet, waehrend der Verlust von p110alpha und p110beta zur verminderten Insulinsensitivitaet fuehrt. Daher schlussfolgern wir, dass p85 eine negative Rolle auf den Insulinsignaltransduktionsweg ausuebt, unabhaengig von der Rolle als p110 Aktivator. Die komplexe Rolle der Klasse Ia PI3K in der Embryonalentwicklung, der Zellwanderung und im Glukosetransport wurde in vivo mit Hilfe von PI3K- defizienten Maeusen und Zelllinien untersucht.
