The primary objective of the current study was to identify two of the highly pathogenic avian influenza virus (HPAIV) isolates of subtype H5N1 genotypically using one step Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), followed by sequence and phylogenetic analyses. A further objective was to determine in vitro the virucidal efficacy of four types of chemical disinfectants, namely Formalin, Glutaraldehyde, TH4® and Virkon®S at different concentrations and contact times on the two HPAI isolates. A/chicken/Egypt/0626/2006 (EGY06) and A/chicken/Egypt/1094/2010 (EGY10) were isolated from cloacal and tracheal swabs from broiler during HPAI H5N1 outbreaks in Egypt in 2006 and 2010. The first strain, EGY06, was isolated from a non-vaccinated flock in February 2006 in the Alexandria governorate. The second strain, EGY10, was isolated from a vaccinated flock in November 2010 in the Marsa Matrouh governorate. Classical identification of the two isolates was carried out in the Department of Poultry and Hygiene, Faculty of Veterinary Medicine, Alexandria University, Egypt. Molecular identification and genetic analyses were conducted in the Gene Analysis Unit of the National Laboratory for Veterinary Quality Control on Poultry Production (NLQP), Egypt. Using RT-PCR with specific sets of primers for H5 and N1 genes of AIV it was confirmed that the two isolates belonged to AI subtype H5N1. After molecular characterization and phylogenetic analysis of the HA and NA genes, the strain EGY06 was closely related to the 2006 predecessor Egyptian viruses of 2.2.1 clade, whereas EGY10 clustered within the classic 2.2.1/c group that commonly isolated from small-scale commercial farms and human since 2009. The efficacy of four chemical disinfectants to inactivate both isolates was carried out in accordance to the guidelines of the German Veterinary Medical Society (Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft, DVG) for testing of disinfection procedures and chemical disinfectants. The experiments were performed using suspension tests without and with protein load (40% Bovine Calf Serum "BCS") as well as wood and gauze as a carriers (also loaded with BCS), at room temperature and incubation times of 15 to 120 min. The obtained results showed that the use of Glutaraldehyde, Formalin or TH4® 0.5% without protein load led to complete inactivation of the virus after 15, 30, 60 or 120 min contact time. Use of Virkon®S 0.5% with and without protein load led to survival of the virus even after 60 min. In contrast, using Formalin and TH4® (1% and 2%) with and without protein load led to complete inactivation of the virus even at the shortest contact time of 15 min. Similar results were obtained after using Glutaraldehyde 1%, while treatment of H5N1 with Glutaraldehyde 2% led to gel formation. After treatment of contaminated carriers (poplar wood and gauze) with Formalin, Glutaraldehyde and TH4® 0.5%, the virus was inactivated after 30 min. Concentration of 1% of the three disinfectants was sufficient to inactivate the two isolates within 15 min contact time, except in case of Virkon®S which required higher concentrations to give similar results. The study indicated that the four chemical disinfectants could efficiently inactivate the two tested H5N1 viruses when used at higher concentration than the manufacturers recommended. The results of the present thesis highlight the sensitivity of HPAIV H5N1 to different disinfectants, which may improve biosecurity measures on the farms and reduce the economic losses caused by HPAIV H5N1.
Das primäre Ziel der aktuellen Studie war es, hoch pathogene aviäre Influenza- Viren (HPAIV) des Subtyps H5N1 genotypisch durch eine einschrittige Reverse Transkriptase- Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) zu identifizieren und anschließend molekularbiologisch zu charakterisieren. Ein weiteres Ziel war, die Wirksamkeit von verschiedenen Konzentrationen und Einwirkungszeiten von vier chemischen Desinfektionsmitteln (Formalin, Glutaraldehyd, TH4® und Virkon®S) auf zwei Stämme (A/chicken/Egypt/0626/2006 "EGY06" und A/chicken/Egypt/1094/2010 "EGY10") des aviären Influenzavirus (AIV) des Subtyps H5N1 in vitro zu prüfen. Die beiden Isolate des AIV-Subtyps H5N1 wurden aus Kloaken- und Trachealtupfern von infizierten Masthühnerherden während der Ausbrüche aviärer Influenza (AI) 2006 und 2010 isoliert. Während der erste Stamm EGY06 aus einer nicht geimpften Herde im Februar 2006 im Gouvernement Alexandria isoliert wurde, wurde der zweite Stamm, EGY10, aus einer geimpften Herde im November 2010 im Gouvernement Marsa Matrouh isoliert. Die klassischen Methoden zur Identifizierung der beiden Isolate wurden in der Abteilung für Geflügel und Hygiene, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Alexandria, Ägypten durchgeführt. Die molekulare Identifizierung und genetische Analyse erfolgten in der Gen- Analyse-Einheit des Nationalen Labors zur Qualitätskontrolle der Geflügelproduktion (NLQP), Ägypten. Mittels RT-PCR unter Verwendung spezifischer Primersets für die H5 und N1 Gene konnte bestätigt werden, dass es sich bei beiden Isolaten um AIV des Subtyps H5N1 handelt. Der molekularen Charakterisierung und der phylogenetischen Analyse der HA und NA zufolge war der Stamm EGY06 sehr eng verwandt mit dem früher im Jahr 2006 isolierten klassischen Stamm und wurde dem Clade 2.2.1 zugeordnet. Im Gegensatz dazu wurde der Stamm EGY10 im klassischen 2.2.1/c Gruppe zugeordnet, welcher häufig von kleinen kommerziellen Farmen und menschlichen seit 2009 isoliert. Die Empfindlichkeit der Viren gegen verschiedene Desinfektionsmittel wurde auf Grundlage der Richtlinien der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft (DVG) für die Prüfung von Desinfektionsverfahren und chemischen Desinfektionsmitteln geprüft. Die Experimente wurden mittels Suspensions-Test ohne und mit Proteinbelastung (40% Bovines Calf Serum (BCS)) sowie auf Keimträgern aus Holz und Gaze, die mit BCS belastet waren, bei Raumtemperatur und Einwirkzeiten von 15 bis 120 Min durchgeführt. Die Verwendung von Glutaraldehyd, Formalin oder TH4® in einer Konzentration von 0,5% führte ohne Proteinbelastung zu einer Inaktivierung der Viren nach allen Einwirkzeiten (15, 30, 60 und 120 Min). Die Verwendung von Virkon®S 0,5% mit und ohne Proteinbelastung führte zum Überleben des Virus sogar nach 60 Min. Demgegenüber führte die Verwendung von Formalin und TH4® in einer Konzentration von 1% und 2% mit und ohne Proteinbelastung zu einer vollständigen Inaktivierung des Virus sogar bei der kürzesten Einwirkungszeit von 15 Min. Ähnliche Ergebnisse wurden nach Verwendung von Glutaraldehyd in einer Konzentration von 1% beobachtet. Die Behandlung von H5N1 mit Glutaraldehyd in einer Konzentration von 2% führte zu einer Gelbildung. Nach der Behandlung von kontaminierten Keimträgern (Pappelholz und Gaze) mit Formalin, Glutaraldehyd und TH4® in Konzentrationen von 0,5% wurde das Virus nach 30 Min inaktiviert. Während eine Konzentration von 1% der drei Desinfektionsmittel ausreichend war, um die beiden Isolate in 15 Min Einwirkzeit zu inaktivieren, konnte dieses Ergebnis im Fall von Virkon®S nicht erreicht werden, und eine höhere Konzentration war erforderlich um ähnliche Ergebnisse zu erzielen. Die Studie zeigte, dass die vier chemischen Desinfektionsmittel, wenn die verwendeten Konzentrationen höher als die vom Hersteller empfohlenen Konzentrationen sind, beide getesteten H5N1 Viren effektiv inaktivieren. Die Ergebnisse dieser Studie bieten einen neuen Ansatz zur Verbesserung der Biosicherheitsmaßnahmen in Geflügelbeständen und können zur Reduzierung der wirtschaftlichen Verluste beitragen.
