Entwicklung von Fluoreszenzpolarisations-Sonden und affinitätsbasierten Photomarkierern für Sialyltransferasen sowie HT-Screening einer Sialyltransferase

Abstract

Die Fähigkeit zu metastasieren ist hauptursächlich für die hohe Letalität bösartiger Tumoren, während Primärtumoren bei rechtzeitiger Erkennung oft erfolgreich behandelt werden können. Zahlreiche unabhängige Studien zeigten einen Zusammenhang zwischen einer erhöhten Sialylierung von Zelloberflächenmolekülen und der Invasions- und Metastasierungsfähigkeit von Tumorzellen. Außerdem besteht häufig eine Korrelation zwischen einer erhöhten Expression von Sialyltransferasen und einer schlechten Prognose. Jedoch sind die zugrundeliegenden biomolekularen Mechanismen nur wenig erforscht, da es an Werkzeugen für in vivo Experimente mangelt. In dieser Arbeit wurden hochaffine und reversibel bindende Fluoreszenzpolarisations-Sonden (FP-Sonde) für Sialyltransferasen entwickelt, indem ein Donorsubstrat-basierter übergangszustandsanaloger Inhibitor von Sialyltransferasen mit Fluorescein markiert wurde. Die Sonden wurden mit zwei Säugetier- (rST3Gal II und hST6Gal I) sowie zwei bakteriellen Sialyltransferasen (Pd2,6ST(N) und PmST1) getestet. Mit ihnen wurde der erste Fluoreszenzpolarisations-Assay (FP-Assay) für Sialyltransferasen etabliert, der Hochdurchsatz-fähig ist. Dies erlaubt das schnelle und einfache Testen von Inhibitoren gegen Sialyltransferasen und macht darüber hinaus Akzeptor- und Donorsubstrat überflüssig. Mit dem entwickelte Hochdurchsatz-FP-Assay (HT-FP-Assay) wurde erstmalig ein Hochdurchsatz-Screen (HTS, >100.000 Compounds/24 h) einer Sialyltransferase (rST3Gal II) gegen eine umfangreiche chemische Bibliothek, bestehend aus 28.864 Substanzen, durchgeführt. Der HT-FP-Assay erwies sich unter HTS- Bedingungen als überaus robust mit exzellenten Z-Werten (> 0.93). Die Validierung von 149 Primärhits ergab 11 Substanzen, die den Schwellenwert für die Aktivität und Reinheit erreichten und ein höheres Inhibitionspotential als Cytidindiphosphat aufwiesen. Sie stellen vielversprechende Leitstrukturen für die Entwicklung neuer Sialyltransferaseinhibitoren dar. Durch Einbau einer photoreaktiven Benzophenongruppe in die FP-Sonden wurde ein Photoaffinitätsmarker entwickelt. Die Bestrahlung mit UV-Licht (~ 366 nm) erlaubte die affinitätsbasierte Markierung der beiden Säugetier- und der beiden bakteriellen Sialyltransferasen. Die Detektion der Markierungsprodukte in SDS-Gelen erfolgte durch Anregung des Fluoresceinrestes gefolgt von Fotographie. Erste Experimente, Volllängen-Sialyltransferasen auch in komplexen Proteomen zu markieren, waren vielversprechend.

Whereas primary tumors can often be treated successfully if detected at an early stage, the main reason for malignant tumors being lethal is their capacity to metastasize. Various independent studies showed that a high extent of sialylated cell surface molecules is related to an increased tendency of tumor cells to undergo invasion and formation of metastases. There is also a correlation between an increased expression of sialyltransferases and poor prognoses. However, biomolecular mechanisms responsible for the observed effects have not been studied in great detail due to the lack of appropriate techniques for in vivo experiments. In this work, highly affine fluorescence polarization (FP) probes were developed that bind to sialyltransferases reversibly. This was achieved through modification of a donor substrate based transition state analogon for sialyltransferases with fluorescein. The probes were tested with two mammalin (rST3Gal II and hST6Gal I) and two bacterial (Pd2,6ST(N) and PmST1) sialyltransferases. Furthermore, the probes were used to establish the first fluorescence polarization assay for sialyltransferase suitable for high-throughput. This allows facile testing of inhibitors against sialyltransferases and makes acceptor and donor substrates redundant. The developed high-throughput fluorescence probe (HT-FP) assay was used to carry out a high-throughput-screening (HTS, > 100 000 compounds/24h) of a sialyltransferase (rST3Gal II) against a library of 28 864 chemical compounds. The assay was found to be robust under HTS conditions and delivered excellent Z-values (> 0.93). The validation of 149 primary hits gave 11 substances that reached the purity and activity threshold, showed higher inhibition potentials than cytidine diphosphate and are promising candidates for the development of new sialyltransferase inhibitors. The photoreactive benzophenone moiety was incorporated in the fluorescence probes to develop photoaffinity markers. Radiation with UV light allowed affinity based marking of the two mammalin and the two bacterial sialyltransferases. The detection of these markers in SDS gels was carried out by excitation of the fluorescein moiety followed by photography. First attempts to label human full-length sialyltransferases in complex proteomes proved to be promising.