Parodontitis ist eine bakteriell induzierte entzündliche Erkrankung des Zahnhalteapparates, von der über die Hälfte der Menschheit weltweit betroffen ist. Das mehrschichtige keratinisierte Epithel der Gingiva, der kontinuierliche Speichelfluss und die Sulkusflüssigkeit stellen jedoch nicht nur eine Barriere für externe Pathogene, sondern ebenfalls für topische Wirkstoffe dar. Core- Multishell (CMS)-Nanocarrier könnten diese Barrieren überwinden, da diese polymeren Konstrukte mit bereits etablierten Wirkstoffen beladen werden und die Adhäsion an bzw. Penetration in die Mundschleimhaut erhöhen können. Die Verfügbarkeit humaner gingivaler Biopsien für diesbezügliche Versuche ist jedoch limitiert. Daher besteht der Bedarf nach einem reproduzierbaren System, das der in vivo-Situation der humanen Gingiva möglichst nahekommt. Das Ziel dieser Arbeit war deshalb die Etablierung inflammatorischer gingivaler 3D-Modelle zur Analyse pathologischer Prozesse der Mundschleimhaut und zur Bewertung potenzieller antiinflammatorischer Therapeutika. Epitheliale Modelle wurden aus immortalisierten (OKG4) und primären gingivalen Keratinozyten (GEC) kultiviert und mittels Immunfluoreszenz (IF) untersucht. Organotypische Schleimhautäquivalente wurden durch die zusätzliche Applikation immortalisierter Fibroblasten in ein Kollagengel etabliert. Proinflammatorische Mediatoren wurden mittels SRB- und MTT- Assay an gingivalen Keratinozyten getestet. Mittels Cytokine-Array und ELISA wurde deren Zytokinsekretion unter Gabe des Parodontitis-assoziierten Zytokins IL-1β untersucht. Der Einfluss von IL-1β auf gingivale Barriereeigenschaften wurde durch Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER), IF-Analyse von Tight Junction (TJ)-Proteinen und Quantifizierung ihrer Expression mittels Western Blot untersucht. IL-1β-stimulierte Schleimhautäquivalente wurden hinsichtlich Morphologie und Zytokinsekretion durch IF und ELISA beurteilt. Auswirkungen des Nanocarriers CMS 10-E-15-350 auf gingivale Keratinozyten wurden mittels SRB- und MTT-Assay, sowie ELISA und WGA-Fluoreszenz untersucht. Unter CMS-Gabe wurde der TEER gemessen und die TJ-Proteinexpression mittels Western Blot bestimmt. Indocarbocyanin-gekoppelter CMS-Nanocarrier wurde auf gingivale Schleimhautäquivalente appliziert und die Penetrationsfähigkeit mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert. IL-1β hatte keinen Einfluss auf Zellmasse, metabolische Aktivität und Morphologie gingivaler Keratinozyten. Jedoch zeigte sich eine zeitabhängige Hochregulation der proinflammatorischen Zytokine IL-6 und IL-8. IL-1β führte weiterhin zu einer Verstärkung der gingivalen Barriere. Die etablierten Modelle waren der humanen Gingiva im morphologischen Aufbau und Differenzierungsgrad sehr ähnlich. Organotypische Schleimhautäquivalente zeigten eine messbare inflammatorische Reaktion nach IL-1β-Gabe. Der Nanocarrier CMS 10-E-15-350 wies eine sehr gute Biokompatibilität auf und konnte bereits nach fünf Minuten im Epithel organotypischer Schleimhautäquivalente detektiert werden. Gingivale dreidimensionale in vitro-aufgebaute Modelle können die native Gingiva nachahmen, reproduzierbar aufgebaut werden und zugleich Versuche am Tier vermeiden. Diese organotypischen Schleimhautäquivalente eignen sich daher zur Beantwortung grundlagenmedizinischer Fragestellungen, ermöglichen ein besseres Verständnis von Krankheitsprozessen und können für die Testung neuer Therapieansätze zur Behandlung entzündlicher Mundschleimhauterkrankungen herangezogen werden. CMS-Nanocarrier scheinen in diesem Zusammenhang ein vielversprechender Ansatz zu sein.
Periodontitis is a bacterial-induced inflammatory disease of the periodontium that affects more than half of the worldwide population. The gingival multi-layered keratinized epithelium, continuous salivary flow and gingival crevicular fluid not only represent a barrier for external pathogens, but also for topical agents. Core-Multishell (CMS) nanocarriers may be an option to overcome these barriers, as they can be loaded with well-established compounds and can increase adhesion to/ penetration into oral mucosa. Since availability of human gingival biopsies is limited, there is a need for reproducible models that mimic the in vivo situation of human gingiva. Therefore, the aim of this work was to establish inflammatory gingival models for the analysis of pathological processes of oral mucosa and evaluation of potential therapeutics. Epithelial models were constructed from immortalized (OKG4) and primary gingival keratinocytes (GEC) and investigated by immunofluorescence analysis. Organotypic mucosal equivalents (OME) were established by additional integration of immortalized fibroblasts. Proinflammatory mediators were tested on keratinocytes using SRB and MTT assays. Cytokine arrays and ELISA were performed to examine their cytokine secretion using periodontitis-associated cytokine IL-1β. The influence of IL-1β on gingival barrier properties was assessed by measuring transepithelial electrical resistance (TEER), immunofluorescence analysis of tight junction (TJ) proteins and quantification of their expression by Western blot method. Morphology and cytokine secretion of IL-1β-stimulated OME were evaluated using immunofluorescence analysis and ELISA. Effects of CMS nanocarrier 10-E-15-350 on keratinocytes were analyzed by SRB and MTT assay, ELISA and WGA fluorescence analysis. In the presence of CMS, TEER was measured and TJ protein expression was analyzed using Western blot analysis. Penetration of indocarbocyanin-coupled nanocarriers into OME was determined by fluorescence microscopy. IL-1β showed no influence on cell mass, metabolic activity, and morphology of gingival keratinocytes. However, a time-dependent upregulation of IL-6 and IL-8 was observed. IL-1β further led to a strengthening of the gingival barrier. The established OME were very similar to human gingiva in morphological structure and degree of differentiation. They showed measurable inflammatory responses after IL-1β administration. CMS 10-E-15-350 showed high biocompatibility and could be detected after five minutes in OME epithelium. Gingival models can mimic native gingiva, be reproducibly constructed, and help to avoid animal experiments. They are therefore suitable for addressing fundamental medical issues, enabling a better understanding of disease processes and evaluating innovative therapeutic approaches for the treatment of inflammatory oral mucosal diseases. CMS nanocarriers seem to be a promising approach in this context.
