Functional characterization of a novel p97:ASPL protein complex

Abstract

Investigating protein-protein interactions (PPIs) in the human cell has proven to be a long lasting endeavor that required the elaborate work of a few generations of scientists. Nowadays, interactome mapping approaches gain more and more interest as they not only deliver insights into the molecular processes which shape cell function and fate, but also represent a so far unexploited source of potential new therapeutic targets. The protein standing in the focus of my work is p97 and despite the great amount of literature describing its functional diversity, still not much is known how mutations in the p97 gene lead to the manifestation of a multisystem disorder called IBMPFD. Nevertheless, some publications reported perturbations in the p97 interaction network to be caused by disease-associated single amino acid exchanges in the protein. This suggests that there is a connection between disease onset or progression and the regulation of the p97 interactome. In order to test this hypothesis, I decided to follow a systematic approach and study in detail second order interaction partners of p97. My aim was to gather information about the mechanisms under their regulation and their disease relevance. One particularly good target for an investigation of this kind is the stable p97:ASPL complex. ASPL in human cells is predominantly present in a p97 bound state and finding ASPL interaction partners increases the chance of detecting complex binders. A SILAC analysis of immunoprecipitated endogenous ASPL and the following validation of its putative interaction partners by LuTHy revealed first indications of p97:ASPL being involved in processes related to pre-mRNA splicing. Three of the validated interaction partners of the complex are involved in the initiation of splicing and spliceosome assembly by recognizing the 3’ splice site in intron sequences. These are the structural homologs PUF60, RBM39 and U2AF2. The interaction between U2AF2 and p97:ASPL is specific and the splicing factor appears to bind to a surface which is only present in the complex. This I was able to show by applying ASPL mutants in the interaction tests. They bind to p97 with a reduced affinity, but most importantly do not form an oligomeric structure with p97 as the wild-type ASPL molecules do. In a domain mapping analysis, I was able to define the domains of U2AF2 responsible for its association with the complex. These are the N-terminal RS-ULM region, which is essential for binding to p97, and the C-terminal UHM domain which is sufficient for the interaction with ASPL. These experiments suggest a bipartite association mode between p97:ASPL and U2AF2. Additionally, I was able to demonstrate their endogenous interaction by a proximity ligation assay (PLA). By a thorough RNA-Seq analysis performed in HEK293 cells I showed that the depletion of ASPL affects the splicing pattern of functionally diverse transcripts in human cells. This effect is dependent on intrinsic sequence features such as the strength of the 3’ splice site. Cassette exons under the regulation of weak 3’ splice sites tend to get skipped more frequently upon ASPL knock-out. I was able to confirm this observation with a specific U2AF2 minigene reporter applied in HeLa cells. Finally, I analyzed the effects of single amino acid exchanges in 26 mutated p97 variants regarding their binding to ASPL and U2AF2. The majority of the tested point mutations affected strongly the interaction between p97 and ASPL and a few of them modified the interaction signal detected between p97 and U2AF2. However, it remains unclear if these mutations lead to fluctuations in alternative splicing in IBMPFD patient derived cells similar to changes observed in ASPL-KO cells. In summary, I can claim that p97:ASPL complexes in human cells have a general role in early splicing events. They are required for maintaining cassette exons with weak 3’ splice sites in matured transcripts. The interaction of p97:ASPL with U2AF2 and other related splicing factors, such as PUF60 and RBM39, is critical for this process.

Die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in der menschlichen Zelle hat sich als langwieriges Unterfangen erwiesen, das die aufwendige Arbeit einiger Generationen von Wissenschaftlern erforderte. Heutzutage gewinnen Ansätze zum Studieren des Interaktoms zunehmend an Interesse, da sie nicht nur Einblicke in die molekularen Prozesse liefern, die die Funktion und das Schicksal der Zellen beeinflussen, sondern auch eine bisher ungenutzte Quelle zur Identifizierung potenzieller neuer therapeutischer Targets darstellen. Das Protein, das im Mittelpunkt meiner Arbeit steht, ist p97. Bis heute ist trotz einer umfassenden Menge an Literatur, die seine funktionelle Vielfalt beschreibt, noch nicht viel darüber bekannt, wie Mutationen im Gen, das p97 kodiert, zur Manifestation einer Multisystemstörung mit dem Namen IBMPFD führen. Dennoch berichten einige Veröffentlichungen, dass Änderungen im p97 Interaktionsnetzwerk durch den Austausch einzelner krankheitsassoziierten Aminosäuren im Protein verursacht werden. Dies deutet darauf hin, dass ein enger Zusammenhang zwischen dem Ausbruch oder dem Krankheitsverlauf und der Störung des p97-Interaktoms besteht. Um diese Hypothese zu testen, beschloss ich, einen systematischen Ansatz zu verfolgen und die p97-Interaktionspartner zweiter Ordnung im Detail zu untersuchen. Damit wollte ich Informationen über die von p97-Interaktionspartnern regulierten zellulären Mechanismen und deren Krankheitsrelevanz sammeln. Als besonders geeignet hierfür erweist sich der stabile p97:ASPL-Komplex. ASPL ist in der menschlichen Zelle überwiegend in einem p97 gebundenen Zustand vorhanden, und das Identifizieren von ASPL Interaktionspartnern erhöht die Wahrscheinlichkeit Proteine zu finden, die an den p97:ASPL Komplex binden. Eine SILAC-Analyse von immunpräzipitiertem endogenem ASPL und die folgende Validierung seiner mutmaßlichen Interaktionspartner durch LuTHy lieferte erste Hinweise darauf, dass p97:ASPL an Prozessen beteiligt ist, die mit dem Reifen von prä-mRNA Molekülen in Verbindung stehen. Drei der validierten Interaktionspartner des Komplexes sind an der Initiierung vom Splicing und der Assemblierung des Spliceosoms beteiligt, indem sie die 3' Splice Stelle in Intronsequenzen erkennen. Dies sind die strukturellen homologen Proteine PUF60, RBM39 und U2AF2. Die Wechselwirkung zwischen U2AF2 und p97:ASPL ist spezifisch und der Splicing Faktor scheint an eine Oberfläche zu binden, die nur vorhanden ist, wenn die Proteine p97 und ASPL einen Komplex eingehen. Dieses Ergebnis konnte ich durch den Einsatz von ASPL-Mutanten und deren Untersuchung in spezifischen Interaktionstests erzielen. Sie binden mit einer verringerten Affinität an p97, bilden aber vor allem keine oligomeren Komplexe mit p97, die normalerweise mit Wildtyp-ASPL-Molekülen entstehen. In einer Domain Mapping Analyse konnte ich die Domänen in U2AF2 identifizieren, die für die Assoziation mit dem Komplex verantwortlich sind. Dies sind die N terminale RS-ULM-Region, die für die Bindung an p97 essentiell ist, und die C terminale UHM-Domäne, die für die Wechselwirkung mit ASPL ausreicht. Zusätzlich konnte ich die endogene Wechselwirkung zwischen den Proteinen mit einem Proximity Ligation Assay (PLA) nachweisen. Durch eine gründliche RNA-Seq-Analyse, die in HEK293-Zellen durchgeführt wurde, zeigte ich, dass die unterbundene Expression von ASPL das Splicing Muster von Transkripten beeinflusste, die nicht funktionell verwandt sind. Dieser Effekt ist abhängig von intrinsischen Sequenzmerkmalen wie der Stärke der 3'-Splice Stelle. Kassetten-Exons, die unter der Regulierung schwacher 3' Splice Stellen stehen, neigen dazu, beim ASPL-Knock-out häufiger übersprungen zu werden. Diese Beobachtung konnte ich mit einem spezifischen U2AF2 Minigen Reporter in HeLa Zellen bestätigen. Schließlich analysierte ich den Effekt des Austausches einzelner Aminosäuren in 26 mutierten p97-Varianten hinsichtlich ihrer Bindung an ASPL und U2AF2. Die Mehrzahl der getesteten Punktmutationen beeinflusste die Wechselwirkung zwischen p97 und ASPL stark und einige von ihnen modifizierten das ermittelte Interaktionssignal zwischen p97 und ASPL. Es bleibt jedoch unklar, ob diese Mutationen zu ähnlichen Schwankungen im alternativen Splicing von Zellen von IBMPFD Patienten führen, wie ich es in ASPL-KO-Zellen beobachtet hatte. Zusammenfassend kann ich sagen, dass meine Arbeiten darauf hindeuten, dass p97:ASPL-Komplexe eine wichtige Rolle beim Splicing von mRNA Transkripten in menschlichen Zellen spielen. Der Komplex ist erforderlich, um die Integrationsraten von Kassetten-Exons mit schwachen 3' Splice Stellen aufrechtzuerhalten. Die Wechselwirkung zwischen p97:ASPL und U2AF2 und den anderen verwandten Splicing Faktoren wie PUF60 und RBM39 ist von großer Bedeutung für diesen Prozess.