Background: Previousresearchessuggest that T-type Cav3.2 channels in arterial vascular smooth muscle cells (VSMCs) and caveolae have contribution on elementary Ca2+ signaling (Ca2+ sparks) via ryanodine receptors (RyRs) to cause vasodilation. RyRs are major Ca2+-release channels in the sarcoplasmic reticulum membrane of myocytes.VSMCs exhibit 3 differentisoforms of RyR (RyR1, RyR2, and RyR3).Here, we aim to elucidate the contribution of caveolar Cav3.2 channels and their functional interaction with Cav1.2 channels to trigger Ca2+ sparks in VSMCs. We also tested the hypothesis that vascular smooth muscle cell RyR2 play a specificrole in Ca2+sparks generation in VSMCs. Methods: We used tamoxifen-inducible smooth muscle-specific Cav1.2-/- (SMAKO) mice, tamoxifen-induciblesmooth muscle cell–specific RyR2-/- mice and laser scanning confocal microscopy to assess Ca2+ sparks in arterial VSMCs. Ni2+, Cd2+ and methyl-ß-cyclodextrin were used to inhibit Cav3.2 channels, Cav1.2 channels, and caveolae, respectively. Results: We found that 50 µmol/L Ni2+ and 10 mmol/Lmethyl-ß-cyclodextrindecreased Ca2+ spark frequency by ~20-30% in mesenteric artery VSMCs in a non-additive manner,but failed to inhibit Ca2+ sparks in tibial and cerebral artery VSMCs. 200 µmol/L Cd2+ suppressed Ca2+ sparks in mesenteric arteries by ~70-80%. A similar suppression of Ca2+ sparks was seen in mesenteric artery VSMCs of SMAKO mice. The remaining Ca2+ sparks were fully abolished by Ni2+ or methyl-ß-cyclodextrin. Our results demonstrate that Ca2+ influx through CaV1.2 channelsis the primary means of triggeringCa2+ sparks in murine arterial VSMCs. CaV3.2 channels, localized to caveolae and tightly coupled to RyR, provide an additional Ca2+ source for Ca2+ spark generation in mesenteric, but not tibial and cerebral arteries. In addition, targeted deletion of the RyR2 gene resulted in a complete loss of sarcoplasmic reticulum–mediated Ca2+-release events. Conclusions: Here we demonstrate that L-type CaV1.2 channels provide the predominant Ca2+ pathway for Ca2+ sparksgeneration in murine arterial VSMCs. T-type Cav3.2 channels are located in pits structures of caveolae to provide locally restricted, tight coupling between T-type Ca2+ channels and RyRs to ignite Ca2+ sparks in mesenteric arteries.Furthermore, RyR2isoform plays a dominant role in local and global VSMCs SRCa2+ release.
Hintergrund: Bisherige Untersuchungen ließen vermuten, dass T-Typ CaV3.2-Kanäle in arteriellen Gefäßmuskelzellen (VSMCs) und Caveolae an elementaren Ca2+-Signalprozessen (Ca2+-Sparks) über Ryanodinrezeptoren (RyRs)zum Auslösen von Vasodilatation beteiligt sind. RyRs sind wichtige Ca2+-Freisetzungskanäle in der Membran des Sarkoplasmatischen Retikulums (SR) von Myozyten. VSMCs exprimieren 3 verschiedene Isoformen von RyR (RyR1, RyR2 und RyR3). Das Ziel dieser Studie war, den Beitrag der caveolaren CaV3.2-Kanäle und deren funktionelle Interaktion mit CaV1.2-Kanäle beim Auslösen von Ca2+-Sparks in VSMCs aufzuklären. Wir überprüften weiterhin die Hypothese, dass RyR2 in Zellen der glatten Gefäßmuskulatur eine spezifische Rolle bei der Erzeugung von Ca2+-Sparks spielen. Methoden: Wir nutzten Tamoxifen-induzierbare Glattmuskel-spezifische Cav1.2-/- (SMAKO) Mäuse, Tamoxifen-induzierbare Glattmuskel-spezifische RyR2-/--Mäuse und Laser-Scanning-Konfokalmikroskopie,um Ca2+-Sparks in VSMCs zu untersuchen. Ni2+, Cd2+und Methyl-ß-cyclodextrin wurden verwendet, um CaV3.2-Kanäle oder CaV1.2-Kanäle zu hemmenbzw. Caveolae aufzufalten. Ergebnisse: Wir haben festgestellt, dass 50 µmol/L Ni2+ und 10 mmol/L Methyl-ß-cyclodextrin die Frequenz der Ca2+-Sparks um ~20-30% in VSMCs aus Mesenterialarterien nicht-additiv verminderten, aber Ca2+-Sparks bei VSMCs aus Tibial- und Zerebralarterien nicht hemmen konnten. 200 µmol/L Cd2+unterdrückte ~70–80% der Ca2+-Sparks in VSMCs aus Mesenterialarterien. Eine ähnliche Hemmung von Ca2+-Sparks fanden wir in VSMCs aus Mesenterialarterien von SMAKO-Mäusen. Die verbliebenen Ca2+-Sparks wurden durch Ni2+ oder Methyl-ß-cyclodextrin vollständig gehemmt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Ca2+-Einstrom durch CaV1.2-Kanäle der Hauptweg zum Auslösen von Ca2+-Sparks in murinen arteriellen VSMCs ist. CaV3.2-Kanäle, lokalisiert in Caveolae und dicht gekoppelt an RyRs, bieten eine zusätzliche Ca2+-Einstromquelle zur Erzeugung von Ca2+-Sparks bei Mesenterial-, aber nicht bei Tibial- oder Zerebralarterien. Darüber hinaus führte die gezielte Deletion des RyR2-Genszueinemvollständigen Verlust von SR-vermitteltenCa2+-Freisetzungsereignissen. Schlussfolgerungen: Wir konnten zeigen, dass L-Typ CaV1.2-Kanäle den Haupt-Ca2+-Einstromweg zur Bildung von Ca2+-Sparks in murinen arteriellen VSMCs darstellen. T-Typ CaV3.2-Kanäle sind innerhalb von Caveolae lokalisiert, um lokal begrenztes, enges Koppeln zwischen den CaV3.2-Kanälen und RyRs zum Auslösen von Ca2+-Sparks in mesenterialarteriellen VSMCs zu ermöglichen. Außerdem spielt die RyR2-Isoform eine dominante Rolle bei der lokalen und globalen Freisetzung von VSMCs SR-Ca2+.
