Characteristics of Rapamycin-treated T cell products for advanced adoptive T cell therapy and evaluation of clinical feasibility

Abstract

The requirement for long-term immunosuppression to prevent rejections predisposes solid organ transplant recipients to severe or fatal viral complications, e.g. caused by cytomegalovirus (CMV). Classical antiviral medication is often problematic or ineffective. Hence, virus-specific adoptive T cell therapy emerged as attractive therapeutic option for viral diseases occurring after transplantation. Despite clinical safety of antiviral T cell products (TCPs) and impressive initial effectiveness, long-term efficacy is frequently limited in SOT recipients. This might originate in the short-term persistence of transferred T cells, which may be associated with a late differentiation state. Inhibition of the mechanistic-Target-of-Rapamycin-(mTOR)-pathway by Rapamycin regulates memory T cell differentiation and was integrated into our clinical protocol for the manufacture of virus-specific TCPs. Thereby, we optimized the T cell subset composition, yielding enriched proportions of early differentiated central-memory (TCM) and CD4+ T cells. Pre-clinical and clinical data imply this to enhance long-term efficacy of adoptive T cell therapy. The aim of the present study was to find evidence for this hypothesis in in vitro experiments by detailed molecular characterization of CMV-specific Rapamycin-treated (Rapa-)TCPs to thoroughly describe the underlying mechanism and to investigate transferability of the manufacturing process to patient samples. Rapamycin-treatment induced preferential expansion and reduced differentiation of virus-specific TCM as well as increasing virus-specific cytokine production of further differentiated CD8+ T cells. Moreover, Rapamycin-treatment resulted in enhanced T cell vitality inter alia in apoptosis-inducing conditions and even after freezing/thawing processes, which are required for clinical application. This may be mediated by increased levels of Bcl-2 protein. RNA sequencing revealed a beneficial transcriptome of Rapa-TCPs. Furthermore, metabolic analysis disclosed Rapa-TCPs to display a more stable metabolism upon CMV-specific activation. Moreover, Rapa-TCPs exhibited a more diverse T cell receptor repertoire, which minimizes potential viral antigen escape. In addition, Rapa-TCP protocol applicability to paired samples from end-stage renal disease patients awaiting living-donor kidney transplantation (KTx) and the same patients after KTx and initiation of immunosuppression was illustrated. These Rapa-TCPs (before/after KTx) showed comparable characteristics, which were similar to Rapa-TCPs from healthy donors. Moreover, Rapa-TCPs were successfully generated from KTx patients with different states of CMV reactivation, identifying patients with recent CMV DNAemia as sensitive target population needing further investigations. The results imply Rapamycin to improve longevity and performance of antiviral TCPs and now await ultimate clinical proof in trials. Translation to other clinically used effector TCPs, may be extremely useful and achieve optimization of long-term efficacy especially for applications in oncology.

In der soliden Organtransplantation ist die Langzeitimmunsuppression eine Voraussetzung, um Abstoßungsreaktionen zu verhindern, prädisponiert allerdings für schwer oder tödlich verlaufende Viruserkrankungen z.B. hervorgerufen durch das Cytomegalievirus (CMV). Die klassische antivirale Medikation ist oftmals problematisch bzw. ineffektiv. Die virusspezifische adoptive T-Zell-Therapie hat sich daher als eine attraktive therapeutische Option zur Behandlung viraler Erkrankungen nach Transplantation herausgestellt. Trotz der klinischen Sicherheit der antiviralen T-Zell-Produkte und einer kurzzeitig beeindruckenden Wirksamkeit, ist die Langzeiteffektivität in Organtransplantierten häufig eingeschränkt. Dies könnte seine Ursache in der kurzzeitigen Persistenz der transferierten T-Zellen haben, was eventuell mit deren späten Differenzierungsstatus assoziiert sein könnte. Eine Inhibition des mechanistic-Target-of-Rapamycin-(mTOR)-Signalwegs mittels Rapamycin reguliert die Gedächtnis-T-Zell-Differenzierung. Diese Strategie wurde durch unsere Arbeitsgruppe zur Verbesserung der Zusammensetzung von T-Zell-Produkten durch Anreicherung frühdifferenzierter zentraler Gedächtnis-T-Zellen sowie CD4+ T-Zellen in unser klinisches Protokoll zur Herstellung antiviraler T-Zell-Produkte integriert. Präklinische und klinische Daten implizieren, dass dies die Langzeitwirkung adoptiver T-Zell-Therapie verstärken kann. In der vorliegenden Arbeit war es das Ziel, in in-vitro-Versuchen Hinweise für eine Bestätigung dieser Hypothese mittels molekularer Charakterisierung von CMV-spezifischen Rapamycin-behandelten (Rapa-)T-Zell-Produkten zu finden, den zu Grunde liegenden Mechanismus genauer zu beschreiben, sowie die Übertragbarkeit des Produktionsprozesses auf Patientenmaterial zu untersuchen. Rapamycin-Behandlung induzierte eine bevorzugte Expansion und verminderte Differenzierung virusspezifischer zentraler Gedächtnis-T-Zellen sowie eine vermehrte virusspezifische Zytokinproduktion weiter differenzierter CD8+ Gedächtnis-T-Zellen. Darüber hinaus führte die Rapamycin-Behandlung zu einer verbesserten Vitalität von T-Zellen u.a. nach Induktion von Apoptose und Einfrier-/Auftauprozessen, welche für eine klinische Applikation nötig sind. Dies könnte durch eine erhöhte Proteinmenge von Bcl-2 vermittelt sein. Bei der Sequenzierung der Ribonukleinsäure aus Rapa-T-Zell-Produkten wurde ein erfolgsversprechendes Transkriptom identifiziert. Des Weiteren zeigten Rapa-T-Zell-Produkte bei CMV-spezifischer Aktivierung einen stabileren Metabolismus. Außerdem verfügten Rapa-T-Zell-Produkte über ein diverseres Repertoire an T-Zell-Rezeptoren, was eine Immunevasion minimieren könnte. Darüber hinaus konnten unbehandelte und Rapa-T-Zell-Produkte aus Proben von Patienten im Endstadium renaler Erkrankungen vor Lebendspende/Transplantation einer Niere sowie derselben Patienten nach Nierentransplantation (unter Immunsuppression) generiert werden. Die Rapa-T-Zell-Produkte, die aus Proben vor und nach Transplantation generiert wurden, zeigten untereinander vergleichbare vorteilhafte Ergebnisse. Die Komposition dieser Produkte ähnelte derer von Rapa-T-Zellprodukten gesunder Spender. Des Weiteren wurden erfolgreich Rapa-T-Zell-Produkte von Patienten mit unterschiedlichem CMV-Reaktivierungsstatus generiert, wobei sich die Gruppe mit kurz zurückliegender CMV-Reaktivierung als sensitive Zielpopulation herausstellte und weitergehende Untersuchungen benötigt. Die Ergebnisse implizieren, dass Rapamycin die Langlebigkeit und Funktionalität von antiviralen T-Zell-Produkten verbessert. Dies muss nun ultimativ in klinischen Prüfungen bestätigt werden. Eine Übertragung auf andere klinische Effektor-T-Zell-Produkte könnte insbesondere auch bei Anwendungen in der Onkologie eine Optimierung der Langzeitwirkung erzielen.