Charakterisierung der molekularen Bindungseigenschaften von 7D-Cadherinen

Abstract

LI- und Ksp-Cadherin gehören zur Familie der 7D-Cadherine, die sich aufgrund auffälliger Strukturmerkmale klar von anderen Cadherin-Familien abgrenzt. In dieser Arbeit wurden die 7D-Cadherine auf zellulärer und Einzelmolekülebene untersucht. Ksp-Cadherin vermittelt in stabil transfizierten CHO-Zellen eine spezifische und Ca2+-abhängige Zellaggregation, die vergleichbar mit der von LI- und E-Cadherin-vermittelten Aggregation ist. Im Gegensatz zu E-Cadherin, ließen sich die 7D-Cadherine mit beta-Catenin nicht kopräzipitieren. Ksp- Cadherin scheint also wie LI-Cadherin nicht über beta-Catenin mit dem Zytoskelett verankert zu sein. Mittels eines Fusionsproteins bestehend aus dem gesamten extrazellulären Anteil des LI-Cadherins fusioniert an die Fc-Teil des humanen IgG1 (LI-Fc) wurde die homotypische LI-Cadherin-Interaktion untersucht. Affinitätschromatographie und Rasterkraftmikroskopie ergaben eine niederaffine Bindung (KD von 27 µM) und eine kurze Lebensdauer (1,4 s). Die Ca2+-Affinität der gesamten LI-Cadherin-Ektodomäne liegt bei einer KD von 0,68 mM und ist hochkooperativ (Hill-Koeffizient von 12). Die Ca2+-Regulation der LI-Cadherin-Interaktion unterscheidet sich hierin deutlich von der des koexprimierten E-Cadherins. In Zellkultur und mittels Laserpinzette wurde eine heterotypische Interaktion von LI- mit E-Cadherin nachgewiesen. Diese Interaktion besitzt hinsichtlich der zytoplasmatischen Verankerung von E-Cadherin die gleiche Qualität wie eine homotypische E-Cadherin-Bindung. Die 7D-Cadherine grenzen sich nicht nur strukturell von anderen Cadherin-Familien ab, sondern besitzen auch unterschiedliche Bindungseigenschaften. Die Koexpression von 7D-Cadherinen mit E-Cadherin legt den Schluß nahe, daß 7D- Cadherine und E-Cadherin gemeinsame Funktionen in einschichtigen, hochprismatischen Epithelzellen ausüben.

LI- and Ksp-cadherin, the members of the 7D-cadherin-family, exhibit distinct structural features which make them unique within the cadherin superfamily. In this thesis, the adhesive properties of 7D-cadherins were analyzed on the cellular and single molecule level. Ksp-cadherin mediates a specific and Ca2+-dependent cell-cell adhesion in transfected CHO cells comparable to that of LI- and E-cadherin. In contrast to E-cadherin, the 7D-cadherins could not be co-immunoprecipitated with beta-catenin. This indicates that Ksp-cadherin like LI-cadherin might not be linked to the cytoskeleton via beta-catenin. Analyzing a fusion protein consisting of the entire extracellular part of LI- cadherin fused to the Fc-part of the human IgG1 (LI-Fc) with affinity chromatography and atomic force microscopy revealed a low affinity homotypic interaction (KD of 27 µM), a short lifetime (1.4 s) and a low unbinding force (27-51 pN at retrace velocities of 150-3000 nm/s). Binding is regulated by low-affinity Ca2+ binding sites (KD of 0.68 mM) with high cooperativity (Hill coefficient of 12). The Ca2+ regulation of the LI-cadherin homotypic binding differs from that of E-cadherin although both proteins are co-expressed in enterocytes. A heterotypic interaction of LI- with E-cadherin was observed in cell culture and laser tweezer experiments. Regarding the cytoplasmic anchorage of E-cadherin, the heterotypic interaction of LI- and E-cadherin showed a similar quality as the homotypic E-cadherin interaction. The 7D- cadherins differ not only structurally from other cadherin families, but have also distinct adhesive properties. The co-expression of 7D- and E-cadherin emphasizes the hypothesis that both share common functions in columnar epithelial cells.