Quantifizierung und detaillierte Charakterisierung von low-density granulocytes in systemischen Vaskulitiden und Inflammationen

Abstract

Neutrophile Granulozyten (PMNs) bilden eine essentielle Komponente des angeborenen Immunsystems, sie wirken hauptsächlich proinflammatorisch. Granulozyten kommen nicht homogen in Funktionen und Eigenschaften vor, wodurch der Begriff „neutrophile Heterogenität“ geprägt wurde. Eine Subpopulation stellen Granulozyten geringer Dichte, sog. „Low-density-Granulocytes“ (LDGs), dar. Eine erhöhte Anzahl an LDGs konnten u.a. in Autoimmunerkrankungen und Sepsis nachgewiesen werden, ihnen wurden sowohl pro- als auch antiinflammatorische Eigenschaften zugeschrieben. Im systemischen Lupus erythematodes (SLE) korreliert der LDG-Anteil mit der Krankheitsaktivität und der Prävalenz von Vaskulitiden. Auch bei Sepsis konnten Zusammenhänge zwischen LDGs und Krankheitsschwere gezeigt werden. Die Zielsetzung dieser Arbeit ist es, die Zusammenhänge zwischen LDGs und systemischen Vaskulitiden sowie zwischen LDGs und systemischen Inflammationen näher zu beleuchten. Die genaue Charakterisierung und Quantifizierung von LDGs soll dabei auch Hinweise auf den bisher unklaren Ursprung von LDGs liefern. Es wurden Vollblutproben von Testpersonen mit systemischen Vaskulitiden und systemischer Inflammation gewonnen und mit denen einer gesunden Kontrollkohorte verglichen. Hierfür erfolgte die Trennung von PMNs und PBMCs, welche LDGs enthalten, mittels Dichtegradientenzentrifugation. Beide Ansätze wurden danach mit fluoreszenzgekoppelten Antikörpern gegen die Oberflächenantigene CD14, CD16, CD86, CD66b, CD177 und HLA-DR gefärbt. Abschließend erfolgte die durchflusszytometrische Messung der Rezeptorexpression und die statistische Auswertung der Daten. Es konnte demonstriert werden, dass LDGs in systemischen Vaskulitiden und Inflammationen vermehrt vorkommen. Gegenüber PMNs kommt es auf LDGs generell zu einer gesteigerten Expression von CD14, CD16 und HLA-DR. Das Vorliegen von systemischen Vaskulitiden und Inflammationen resultiert in einer verminderten Expression von CD16, zudem ist das Vorkommen CD14-positiver LDGs in systemischen Vaskulitiden erhöht. In systemischen Inflammationen liegt eine negative Korrelation zwischen LDG-Anteil und CRP, Krankheitsaktivität sowie Mortalität vor. In vitro Stimulationen von Vollblut gesunder Probanden führten zu einer Erhöhung des LDG-Anteils. 10 Ein erhöhter LDG-Anteil ist ein Merkmal systemischer Vaskulitiden und Inflammationen und daher Hinweis auf erhöhte Immunaktivität. Hohe LDG-Anteile stellen sich in systemischen Inflammationen als günstiger Marker für Krankheitsschwere und Mortalität dar, damit könnte der LDG-Anteil einen Wert als Prognosemarker haben. Die erhöhte Expression von CD14, CD16 und HLA-DR scheint ein inhärentes Merkmal von LDGs gegenüber PMNs zu sein, sie tritt in allen Testgruppen unabhängig auf. Dahingehend weisen LDGs Ähnlichkeit zu Monozyten auf. In systemischen Inflammationen und Vaskulitiden zeigt sich eine geringere Expression von CD16 auf LDGs, dies kann als Hinweis auf eine immunsuppressive Funktion gesehen werden. Durch in vitro-Stimulation von Vollblut lässt sich ein erhöhter LDG-Anteil provozieren. Dies spricht dafür, dass es sich bei LDGs nicht um Vorläuferzellen, sondern um ausgereifte, eventuell degranulierte Granulozyten handelt.

Neutrophil granulocytes (PMNs) are an essential in innate immunity, they act primarily proinflammatory. Granulocytes are not homogeneous in functions and characteristics, therefore the term "neutrophilic heterogeneity" has been created. There is a distinct subpopulation of low-density granulocytes (LDGs). LDGs were isolated in autoimmune diseases and sepsis, they have been attributed both pro- and anti-inflammatory characteristics. In systemic lupus erythematosus (SLE), the proportion of LDG correlates with disease activity and the prevalence of vasculitis. In sepsis associations between LDGs and disease severity were found. The aim of this work is to analyse the relationships between LDGs and systemic vasculitis as well as between LDGs and systemic inflammations. The exact characterization and quantification of LDGs should also provide information on the unclear origin of LDGs. Whole blood samples of test persons with systemic vasculitis and systemic inflammation were taken and compared with those from healthy controls. Density gradient centrifugation has been used to separate PMNs from PBMCs, which contain LDGs. Both were stained with fluorescently labelled antibodies against surface antigens of CD14, CD16, CD86, CD66b, CD177 and HLA-DR. Then the receptor expression was measured by flow cytometry. The resulting data were statistically analysed. We found increased LDG levels in patients with systemic vasculitis and inflammation. Compared to PMNs, LDGs generally show increased expressions of CD14, CD16 and HLA-DR. The presence of systemic vasculitis and inflammation results in decreased expressions of CD16. The incidence of CD14-positive LDGs in systemic vasculitis is increased. In systemic inflammations, a negative correlation between LDG level and CRP, disease activity, and mortality was found. In vitro stimulation of whole blood from healthy individuals caused increased LDG levels. Increased LDG levels are a characteristic of systemic vasculitis and inflammation, so it could indicate increased immune activity. High LDG levels in systemic inflammations represent a more favourable prognosis regarding disease severity and mortality, therefore the LDG level could be a potential prognostic marker. The increased expression of CD14, CD16 and HLA-DR appears to be an inherent feature of LDGs over PMNs, 12 occurring independently in all test groups. In this regard, LDGs have similarities to monocytes. In systemic inflammations and vasculitis, lower expression of CD16 were shown on LDGs, which may be considered an indication of immunosuppressive functions. In vitro stimulation of whole blood can provoke higher LDG levels. This indicates that LDGs are not progenitor cells but mature, possibly degranulated granulocytes.