Structural and biochemical studies on the aryl hydrocarbon receptor and on the immunity-related GTPase Irga6

Abstract

In my PhD thesis, I addressed two different topics. The first part dealt with the structural and biochemical characterization on the aryl hydrocarbon receptor (AhR). This protein belongs to the bHLH-PAS family of transcription factors that sense environmental signals. As all members of this family, AhR comprise a bHLH domain, necessary for DNA binding, a PAS A domain, necessary for dimerization, a PAS B domain, which in case of AhR is able to bind ligands and an unstructured TAD domain, involved in transactivation. Upon ligand binding, AhR heterodimerizes with the aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator (ARNT), which also belongs to the bHLH-PAS family of transcription factors. Through this dimerization, the fully active heterodimeric transcription factor is formed. Depending on the ligand, transcriptional activation orchestrates the expression of genes required for detoxification, pro-tumor and anti-tumor pathway or immune response. In this study, AhR was functionally and structurally characterized to better understand the process of heterodimerization and DNA binding on a molecular level. This study showed for the first time successful co-expression and co- purification of the AhR/ARNT heterodimeric transcription factor complex comprising the bHLH and PAS A domains. The AhR/ARNT complex appeared properly folded and heterodimerized in a 1:1 stoichiometry. The affinity of the AhR/ARNT complex towards dsDNA containing the DRE was in the lower nano-molar range. This interaction was formed by one molecule AhR/ARNT complex and one molecule double stranded (ds)DNA. The AhR/ARNT complex bound to 12mer dsDNA was crystallized and crystals were extensively optimized. The optimized crystals diffracted anisotropically up to 3.5 Å and various phasing attempts were carried out in order to solve the structure of the AhR/ARNT complex bound to dsDNA. Although structure determination was not achieved within this study, the success of high yield purification of AhR/ARNT complex and biochemical characterization in vitro is a mile stone for further structural investigations. The second part of this study dealt with the structural characterization of the immunity-related GTPase Irga6. Immunity-related GTPases (IRGs) constitute a powerful cell-autonomous resistance systems against several intracellular pathogens in mice. In mice, 23 paralogs of IRG proteins are identified and Irga6 is one of the best studied members of the family. Irga6 is composed of a G domain flanked by a C-terminal and an N-terminal helical domain. Biochemical studies analyzed an interface, which spans over the nucleotide binding pocket of the G domains and is crucial for nucleotide-dependent oligomerization and cooperative GTP-hydrolysis. However, the already known crystal structures of Irga6 show a dimerization mode via the backside dimer but do not reveal this G domain interface. In this part of the study, the structure of a non-oligomerizing Irga6 mutant bound to GMPPNP was solved. This new structure reveals the G domain interface and thus a new mode of G domain dimerization for the IRG family. Beside the nucleotide, two additional interfaces participate in G domain dimerization. A hydrogen bonding network between the switch II and the trans stabilizing loop as well as hydrophobic interactions between the switch I loop and the trans activation loop and the G4 loop establish the G domain dimer interface. These findings are in excellent agreement with the previously published biochemical data. Based on the solved G dimer structure in combination with the published biochemical data and the structural information available for BDLP I proposed an oligomerization model of Irga6 with the G dimer as a nucleotide-dependent interaction interface.

Innerhalb dieser Arbeit wurden zwei Themen behandelt. Zunächst befasst sich die Arbeit mit der strukturellen und biochemischen Charakterisierung des Aryl- hydrocarbon-rezeptors (AhR). Dieser gehört zu der bHLH-PAS-Domänen Familie der Transkriptionsfaktoren und reagiert auf unterschiedlichste Umwelteinflüsse. AhR besteht, wie alle Mitglieder dieser Proteinfamilie, aus einer bHLH Domäne, welche die DNA Bindung ermöglicht, aus einer PAS A Domäne, notwendig für die Heterodimerisierung, einer PAS B Domäne, welche im Falle von AhR Liganden binden kann, sowie einer unstrukturierten TAD Domäne. Durch Ligandenbindung wird AhR aktiviert und heterodimerisiert mit dem Aryl-hydrocarbon-rezeptor- nuclear-translocator (ARNT), ebenso Mitglied der oben genannten Proteinfamilie, zu einem aktiven, heterodimeren Transkriptionsfaktor. Dieser Komplex kann bestimmte DNA Motive binden und dadurch die Transkription aktivieren. Abhängig von der Art des Liganden wird die Transkription von unterschiedlichen Genen aktiviert, welche wiederum die Detoxification, das Tumorwachstum oder aber die Immunantwort beeinflussen können. Um die Heterodimerisierung und DNA-Bindung auf molekularer Ebene zu verstehen, wurde in dieser Studie AhR funktionell und strukturell charakterisiert. Erstmalig konnte hier die Coaufreinigung und Coexpression der bHLH und PAS A Domänen des AhR/ARNT Komplexes gezeigt werden. Die weitere Charakterisierung ergab, dass der AhR/ARNT Komplex korrekt gefaltet ist und aus jeweils einem Molekül AhR und ARNT geformt wird. Die Affinität des AhR/ARNT Komplexes zu doppelsträngiger DNA, welche ein DRE Motiv beinhaltet, liegt im niedrigen nanomolaren Bereich. Jeweils ein Molekül AhR/ARNT Komplex und ein Molekül doppelsträngige DNA sind an der Interaktion beteiligt. Der AhR/ARNT Komplex, gebunden an ein Molekül doppelsträngiger DNA, wurde kristallisiert und die Kristalle wurden umfangreich optimiert. Durch die Optimierung konnte eine Diffraktion der Kristalle bis zu einer Auflösung von 3.5 Å erreicht werden. Zahlreiche Phasierungsmethoden wurden angewendet, um die Kristallstruktur des AhR/ARNT Komplexes, gebunden an doppelsträngige DNA, zu lösen. Obwohl die Strukturbestimmung in dieser Studie nicht gelang, ist der Erfolg der Aufreinigung von AhR im Komplex mit seinem Interaktionspartner ARNT und dessen biochemischen Charakterisierung in vitro als hervorragende Basis für weiterführende strukturelle Studien zu sehen. Der zweite Teil dieser Arbeit behandelt die strukturelle Charakterisierung der immunity-related GTPase (IRG) Irga6. Diese stellen in Mäusen ein wirkungsvolles, zellautonomes Resistenzsystem gegen diverse interzelluläre Pathogene dar. In Mäusen sind insgesamt 23 Paraloge der IRG Proteine identifiziert, wobei Irga6 das wohl am besten studierte Mitglied der Proteinfamilie ist. Irga6 besteht aus einer N- und C-terminalen, helikalen Domäne sowie aus einer G Domäne, welche Nukleotid- abhängige Oligomerisation und kooperative GTP Hydrolyse bewirkt. Biochemische Studien zeigten, dass die für Oligomerisation und kooperative GTP Hydrolyse nötige Interaktionsfläche den Bereich der Nukleotidbindetasche der G Domäne von Irga6 mit einschließt. Die bisher bekannten Kristallstrukturen von Irga6 konnten jedoch diese G Domänen Dimerisierung nicht darstellen. In diesem Teil der Studie wurde eine oligomerisations-defizite Irga6 Mutante, gebunden an GMPPNP, strukturell charakterisiert, um die G Domänen Interaktion zu verstehen und die Oligomerisation von Irga6 zu erklären. In der Tat konnte die Kristallstruktur der Irga6 Mutante, gebunden an GMPPNP, gelöst und ein neuer Mechanismus der G Domänen Dimerisierung beschrieben werden, welcher das Nukleotid involviert. Neben dem Nukleotid konnten zwei weitere Interaktionselemente identifiziert werden, die die G Domänen Dimerisierung stabilisieren. Ein Wasserstoffbrückennetzwerk zwischen der switch-II-Schleife und der trans-Stabilisierungs-Schleife sowie hydrophobe Wechselwirkungen zwischen der Switch-I-Schleife und der G4-Schleife bzw. der trans- Stabilisierungs-Schleife tragen hier zur Stabilisierung bei. Insgesamt bestätigt die hier präsentierte Kristallstruktur die bekannten biochemischen Daten. Basierend auf der hier ermittelten Kristallstruktur von Irga6, den strukturellen Informationen zu BDLP und den bekannten biochemischen Daten schlage ich ein Oligomerisationsmodell für Irga6 vor, welches die neu entdeckte nukleotidabhängige G Domänen Dimerisierung zur Grundlage hat.