RNA sequencing, gene expression analysis, and immunohistochemical studies in dogs with chronic hepatitis and hepatic fibrosis

Abstract

Chronic hepatitis is a well-recognized cause for hepatic fibrosis in dogs. For the majority of chronic hepatitis cases an etiology cannot be determined and the pathophysiology of chronic hepatitis and hepatic fibrosis is still not fully understood. Evaluation of gene expression can provide insight into disease mechanisms and lead to the identification of candidate biomarkers. The aim of the RNA sequencing study was to identify differential gene expression in dogs with chronic hepatitis compared to healthy control dogs. Additionally, tissue expression of selected markers was investigated by immunohistochemistry. The first part of this study analyzed the transcriptome of liver samples of dogs with chronic hepatitis and fibrosis compared to healthy dogs. Six-hundred-and-fifty-one genes were significantly differentially expressed in dogs with chronic hepatitis. Pathway analysis revealed a connection to pathways involved in hepatic fibrosis: genes for growth factors (e.g., CTGF, PDGFD), chemokines and chemokine receptors (e.g., CCL2, CCL5, CXCL10, CCR5, CXCR3), matrix collagens (e.g., Col1A1, Col3A1), and genes for ECM remodeling (e.g., TIMP-1, MATN3, ADAMDEC1, CHI3L1, MMP9, MMP2) are upregulated in dogs with hepatic fibrosis. These genes also play important roles in the pathophysiology of hepatic fibrosis in humans. The second part of the study investigated the tissue distribution and expression of cytoglobin, tissue inhibitor of metalloproteinase 1, proliferation marker Ki67, and alpha- smooth muscle actin with immunohistochemistry. Expression was evaluated in association with the fibrotic stage. Neither cytoglobin nor tissue inhibitor of metalloproteinase 1 were shown to be specific markers for hepatic stellate cells or were able to distinguish between quiescent and activated hepatic stellate cells. However, Ki67 and alpha-smooth muscle actin were differentially expressed between dogs with different stages of hepatic fibrosis.

Die chronische Hepatitis des Hundes ist eine häufige Ursache für Leberfibrose. Die Ursache für die chronische Hepatitis kann allerdings in den meisten Fällen nicht festgestellt werden und auch die Pathophysiologie ist noch nicht vollständig geklärt. Die Analyse der Genexpression kann Einblick geben in die beteiligten Mechanismen und Hinweise zulassen auf potentielle neue Biomarker. Das Ziel der Studie war die Untersuchung der Genexpression bei Hunden mit chronischer Hepatitis im Vergleich zu gesunden Hunden mit Hilfe von RNA- Sequenzierung. Zusätzlich wurde die Gewebeexpression ausgewählter Marker immunhistochemisch untersucht. Der erste Teil der Arbeit befasst sich mit der Transkriptomanalyse aus Leberbiopsien von Hunden mit chronischer Hepatitis und Fibrose im Vergleich zu gesunden Hunden. Bei Hunden mit chronischer Hepatitis konnte für über 600 Gene eine signifikant veränderte Expression festgestellt werden. Eine Pathwayanalyse ergab Verbindungen zu Signalwegen, die eine wichtige Rolle bei hepatischer Fibrose spielen. Gene für Wachstumsfaktoren (z.B., CTGF, PDGFD), Gene für Chemokine und Chemokinrezeptoren (z.B., CCL2, CCL5, CXCL10, CCR5, CXCR3), Gene für Matrixkollagene (z.B., Col1A1, Col3A1) und Gene für Faktoren für den Umbau der extrazellulären Matrix (z.B., TIMP-1, MATN3, ADAMDEC1, CHI3L1, MMP9, MMP2) zeigen erhöhte Expression während chronischer Hepatitis und Fibrogenese bei Hunden. Von dem, was aus Human- und Nagerstudien bekannt ist, spielen die Genprodukte aller genannten Gene eine wichtige Rolle in der Pathophysiologie der Leberfibrose. Der zweite Teil der Arbeit untersuchte die Gewebeverteilung und -expression von Cytoglobin, Tissue Inhibitor of Metalloproteinase 1, Proliferationsmarker Ki67 und von Alpha Smooth Muscle Actin mittels Immunhistochemie. Die Expression der Marker wurde in Relation zum Fibrosestadium betrachtet. Weder Cytoglobin noch Tissue Inhibitor of Metalloproteinase 1 ist ein spezifischer Marker für hepatische Sternzellen des Hundes. Ebensowenig ist es möglich, mit diesen Markern zwischen ruhenden und aktivierten hepatischen Sternzellen zu unterscheiden. Jedoch zeigten Ki67 und Alpha Smooth Muscle Actin differentielle Expression bei Hunden mit unterschiedlichen Fibrosestadien.