Differential Regulation of glutamatergic and GABAergic synaptogenesis by BDNF and PRG1

Abstract

Local extracellular cues are regarded as crucial for the establishment of neuronal connectivity, as they may facilitate neurite development, mutual recognition of the pre- and postsynaptic targets, and/or stabilization of the synaptic contacts. The aim of this study was to further clarify the role of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and plasticity-related gene-1 (PRG-1) in dendrite growth and synapse formation of primary hippocampal or entorhinal cortical neurons. Effects of BDNF on neurite outgrowth and synaptic transmission have been reported earlier, but based on experiments with exogenous BDNF, BDNF-neutralizing antibodies, BDNF gene inactivation or BDNF overexpression in wild-type neurons. The role of PRG-1 in dendrite development and synapse formation/stabilization in single neurons has not yet been explored. To characterize the local effects of BDNF, an experimental model was established to provide a neuronal source of local BDNF. Single neurons in low density primary neuronal cultures from the hippocampus of E18 bdnf-/- mice were transfected with a BDNF::EGFP plasmid construct. After an expression time of 16 h (or in few experiments, 72 h) the cultures were fixed and subjected to immunocytochemical analysis for a change in dendrite geometry and synapse numbers. Specific antibodies and combined immunostaining were used to visualize and quantify glutamatergic and GABAergic synaptic terminals separately. The data were complemented by experiments with quantitative PCR, siRNA-transfection and treatment with a variety of receptor-specific blockers. In the present study, evidence to support the following conclusions is reported: 1) Neurons expressing BDNF display changes in dendrite morphology: they exhibited weaker dendrite elongation (fewer dendritic trees with a length >50 µm), but stronger dendrite initiation (a larger number of primary dendrites and higher-order branches). 2) Neurons expressing BDNF attract a larger total number of synaptic terminals. 3) A cellular source of BDNF produces stronger up-regulation of synaptic terminal numbers than ambient BDNF at high concentration (100 ng/ml). 4) Glutamatergic and GABAergic synaptic terminals react in a differential manner to postsynaptic BDNF. The strength of the glutamatergic input increases, while the strength of GABAergic input decreases. 5) The up-regulation of glutamatergic synaptic input by the postsynaptic BDNF requires TrkB activity. 6) The transfected BDNF (t-BDNF)-induced downregulation of GABAergic synaptic terminal numbers and dendrite elongation is prevented by block of TRkB. In addition, these two suppressive actions of t-BDNF are precluded by GluR block suggesting that the suppression is associated with t-BDNF-stimulated GluR activity. 7) Block of p75 cannot prevent the BDNF-induced changes in dendrite length and synapse numbers, but it reduces the branching response to BDNF transfection. 8) Suppression of PRG-1 expression results in a decrease of synaptic terminal numbers, whereas PRG-1-overexpression attenuates the LPA-induced loss of glutamatergic synapses. Based on these results we propose that (i) postsynaptic expression and release of BDNF and its binding to presynaptic TrkB receptors boosts the glutamatergic synaptic input. The contribution of p75 to this glutamatergic upregulation is small, if at all existing. (ii) The arrest of dendritic length growth and the downregulation of GABAergic synaptic input are consequences of the enhanced glutamate receptor activity rather than a result of direct action of BDNF on TrkB receptors on the postsynaptic dendrites or presynaptic GABAergic terminals, respectively. (iii) Dendrite initiation is controlled by p75 and reflects the level of ambient neurotrophin concentration (and the action of other ligands of p75). In this process, the impact of glutamatergic synaptic input is less obvious. iv) PRG-1 can act as membrane-bound postsynaptic stabilizer of glutamatergic synaptic terminals.

Lokale extrazelluläre Signale sind kritische Faktoren der neuronalen Konnektivität, da sie die Neuritenentwicklung, die wechselseitige Erkennung der prä- und postsynaptischen Partner und/oder die Stabilisierung der synaptischen Kontakte kontrollieren. Das Ziel dieser Studie war, die Rolle von brain-derived neurotrophic factor (BDNF) und von plasticity-related gene-1 (PRG-1) in der Regulation von Dendritenwachstum und Synaptogenese zu klären, und zwar in kultivierten Neuronen aus Hippokampus und entorhinalem Kortex. Über Einflüsse von BDNF auf Neuritenwachstum und synaptische Transmission finden sich bereits Hinweise in der Literatur. Die früheren Studien basieren jedoch auf Experimenten mit exogenem BDNF, BDNF-neutralisierenden Antikörpern, BDNF-Geninaktivation oder BDNF-Überexpression in Wildtyp-Neuronen, also Konditionen, die allesamt den Einfluß von Konzentrationsgradienten des diffundiblen BDNF-Moleküls vernachlässigen. Die Bedeutung von PRG-1 für Dendritenwachstum und Synapsenbildung/-stabilisierung wurde noch nicht untersucht. Um die lokalen Effekte von BDNF darzustellen, sollte im Rahmen dieser Arbeit ein Testmodell entwickelt werden, das erlaubt, BDNF-defizienten Neuronen eine limitierte zelluläre Quelle von BDNF anzubieten. Einzelne Neurone in low density Primärkulturen des Hippokampus der E18 bdnf-/--Maus sollten mit einem BDNF::EGFP-Plasmid transfiziert werden. Nach einer kurzen Expressionszeit sollten die interessierenden Marker immunzytochemisch dargestellt werden. Anhand einer hochauflösenden digitalen Darstellung der Fluoreszenz sollte die Dichte der Neuronen, die Struktur der Dendriten sowie die Zahl und Verteilung der Synapsen quantifiziert werden. Hinzu kamen Untersuchungen mit quantitativer PCR und Experimente mit siRNA-Transfektion. Das neue Versuchsmodell wurde erfolgreich etabliert. An mehr als 1000 transfizierten Neuronen wurden spezielle Tests zur Wirkung von BDNF und PRG-1 auf die Dendritenmorphologie und Synapsenbildung durchgeführt. Wir präsentieren Evidenzen für die folgenden neuen Erkenntnisse: 1) Im Vergleich mit BDNF-defizienten Neuronen zeigen BDNF-exprimierende Neurone Veränderungen in der Dendritenmorphologie. Unter dem Einfluß von BDNF wird das dendritische Längenwachstum reduziert und das Auswachsen von primären Dendriten und Dendritenzweigen höherer Ordnung angeregt. 2) BDNF-exprimierende Neurone werden von mehr präsynaptischen Terminalien kontaktiert als BDNF-defiziente Neurone. 3) Eine zelluläre BDNF-Quelle produziert stärkere Veränderungen von Dendritenwachstum und Synapsenzahlen als diffus verteiltes exogenes BDNF in hohen Konzentrationen (100 ng/ml). 4) Glutamaterge und GABAerge synaptische Terminalien reagieren verschieden auf das postsynaptische BDNF. Während die Stärke des glutamatergen Eingangs ansteigt, nimmt die Stärke des GABAergen Eingangs ab. 5) Die durch das postsynaptische BDNF induzierte Aufregulierung der Zahl der glutamatergen Kontakte erfordert TRkB-Aktivität. 6) Die durch transfiziertes BDNF induzierte Suppression des dendritischen Längenwachstums und die Abregulierung der Zahl der GABAergen synaptischen Terminalien wird ebenfalls durch TrkB-Blockade verhindert. 7) Blockade des niederaffinen gemeinsamen Neurotrophinrezeptors p75 hat keine Auswirkungen auf die Dendritenlänge und die Synapsenzahlen, reduziert aber die BDNF-induzierte Verzweigung der hippokampalen Dendriten. 8) Eine Inhibierung der PRG-1-Expression mit der entsprechenden siRNA führt zu einer Reduktion in der Zahl der synaptischen Terminalien, während PRG-1-Überexpression einen LPA- induzierten selektiven Verlust von glutamatergen Synapsen verhindert. Auf der Grundlage dieser Ergebenisse diskutieren wir die folgenden Hypothesen: i) Die postsynaptische Expression und Freisetzung von BDNF und dessen Bindung an TrkB resultiert in einer starken selektiven Potenzierung der glutamatergen Synaptogenese und, entsprechend, der Glutamatfreisetzung. Dabei leistet p75 keinen nenneswerten Beitrag. ii) Die Arretierung des dendritischen Länenwachstums und die Abregulierung der GABAergen Synapsen sind Folgen der BDNF-induzierten synaptischen Glutamatfreisetzung und nicht die Konsequenz einer direkten suppressiven Wirkung von BDNF auf präsynaptische TrkB- Rezeptoren der GABAergen Synapsen. iii) Die Dendritenneubildung wird dagegen durch p75 kontrolliert und spiegelt die Konzentration des extrazellulären BDNF in der Umgebung der transfizierten Zelle wider. In der Induktion von Dendritenzweigen spielt TrkB eine untergeordnete Rolle. iv) PRG-1 erfüllt die Rolle eines membrangebundenen synapsenstabilisierenden Faktors, mit präferenzieller Wirkung auf exzitatorische Synapsen.