Characterization of microRNA (miRNA) profiles in selected female reproductive tissues of cattle: prediction of fertility associated pathways

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) are small non coding RNAs, able to bind to mRNA and silence gene expression. They have been described to have roles in physiological, as well as in pathological reproductive processes. Reproductive performance in cattle has been steadily decreasing over the last decades. The reasons for this have not been completely defined, but poor embryo development and implantation are among the main causes. Both processes depend on embryo interactions with the maternal oviduct and endometrium. Therefore, the aim of this study was to characterize the role of miRNAs in these reproductive tissues and to predict their function in the context of fertility. First, a bovine oviductal epithelial cell culture (BOEC) system was developed. The purpose of this was to establish an in vitro model that can resemble the oviductal epithelium. To do this, an air liquid interphase system was implemented and cells were grown for up to six weeks. As a result, cells exhibited polarization and markers of differentiation. However, ciliated cells were not observed. Insulin, a common supplement used to culture BOECs, was detected to significantly impact cell morphology, improving the quality of cultures. Additionally, oviductal miRNAs were characterized in native tissue and then validated in the established air-liquid interphase BOEC system. Among the RNAseq-detected oviductal miRNAs, let-7a-5p and let-7c were found to be regulated by insulin in BOECs. Their targets were mapped to MAPK signaling pathway, a downstream mechanism in the insulin signaling, controlling cell proliferation and differentiation. Secondly, miRNAs were characterized in endometrial cells. Estrous cycle was divided into four stages: post-ovulatory, early luteal, late luteal and pre-ovulatory phases. RNA samples of four animals were pooled and the miRNA expression pattern analyzed via RNAseq. Results demonstrated a high similarity in miRNA expression profiles across the estrous cycles in bovine endometrium. These miRNAs were predicted to regulate pathways involved in cell proliferation, differentiation, transport and catabolism, among them, MAPK signaling pathway. To test for functional regulations in vitro, endometrial miRNAs were analyzed using a commercial bovine endometrial cell line (BEND), where activation of MAPK signaling pathway can be counter-regulated by interferon-tau (IFNT), mimicking the process of embryo implantation. As result, miR-106a responded to IFNT alone and in combination with progesterone, a strong indicator of the relevance of this miRNA for embryo implantation. In summary, the present study characterized miRNAs expressed in key reproductive tissues for embryo development. Upon validation using in vitro systems, regulated miRNAs were detected. In BOECs let-7a-5p and let-7c were regulated by insulin and in BEND cells, miR-106a was regulated by IFNT. Interestingly, in both situations, MAPK signaling pathway plays a central role. Future studies will define the role of miRNAs in the control of oviductal and endometrial function through MAPK signaling pathway.

MicroRNAs (miRNAs) sind kleine, nicht kodierende RNAs, welche in der Lage sind mRNA zu binden, um die Genexpression zu inhibieren. Es wurde nachgewiesen, dass sie sowohl im physiologischen als auch im pathologischen Reproduktionsgeschehen eine Rolle spielen. Die Reproduktionsleistung bei Rindern hat in den vergangenen Jahrzehnten stetig abgenommen. Die Gründe dafür sind nicht abschließend aufgeklärt, aber Störungen in der Entwicklung und Implantation der Embryonen gehören mit zu den Hauptursachen. Beide Prozesse sind von Interaktionen des Embryos mit dem mütterlichen Eileiter und Endometrium abhängig. Daher war das Ziel der vorliegenden Untersuchung, die Rolle der miRNAs in diesen Reproduktionsgeweben zu charakterisieren und ihre Funktion im Zusammenhang mit der Fruchtbarkeit vorherzusagen. Zunächst wurde ein System zur Kultivierung von Rinder-Eileiterepithelzellen (BOEC) entwickelt. Es sollte ein in-vitro-Modell etabliert werden, das dem Eileiterepithel möglichst ähnlich ist. Deshalb wurde ein „Air-Liquid- Interphase-System“ angewendet, in dem die Zellen bis zu sechs Wochen kultiviert wurden. Dies bewirkte bei den Zellen Polarisation und weitere Kennzeichen von Differenzierung. Zilienentwicklung konnte allerdings nicht beobachtet werden. Es stellte sich heraus, das Insulin – ein üblicher Zellkultur-Zusatz für BOECs – die Zellmorphologie Konzentrationsabhängig beeinflusst und in bestimmten Konzentrationen die Qualität der Kulturen verbessern kann. Darüber hinaus wurden die im Eileiter exprimierten miRNAs im nativen Gewebe charakterisiert und dann im etablierten BOEC-Kultursystem validiert. Bei den mittels RNAseq detektierten Eileiter-miRNAs stellte sich heraus, dass let-7a-5p und let-7c in BOEC von Insulin reguliert werden. Diese miRNAs konnten über ihre Targets mit dem MAPK-Signalweg in Verbindung gebracht werden, einem nachgeschalteten Mechanismus in der Insulin-Signalkaskade, welcher die Zellproliferation und Zelldifferenzierung kontrolliert. Weiterhin wurden miRNAs in Endometriumszellen charakterisiert. Der Brunstzyklus wurde in vier Stadien geteilt: die postovulatorische Phase, die frühe Lutealphase, die späte Lutealphase und die präovulatorische Phase. RNA-Proben von vier Tieren wurden gesammelt und das miRNA-Expressionsmuster wurde mittels RNAseq analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die miRNA-Expressionsprofile im Endometrium des Rindes über den Zyklus sehr ähnlich bleiben. Die detektierten miRNAs könnten Pathways regulieren, welche Zellproliferation, Differenzierung, Transport und Katabolismus beeinflussen, unter Ihnen auch der MAPK-Signalweg. Um funktionale Interaktionen in vitro zu testen, wurden endometriale miRNAs unter Verwendung einer kommerziellen Rinder-Endometrium-Zelllinie (BEND) analysiert. In diesen Zellen kann die Aktivierung des MAPK-Signalweges durch Interferon-tau (IFNT) gegenreguliert werden, was den Prozess der Implantation des Embryos nachahmt. MiR-106a reagierte sowohl auf IFNT als auch IFNT in Verbindung mit Progesteron, was ein starker Indikator für die Relevanz dieser miRNA für die Implantation des Embryos ist. Zusammenfassend hat die vorliegende Studie gezeigt, dass die entscheidenden Reproduktionsgewebe für die Entwicklung des Embryos miRNAs exprimieren. Nach der Validierung unter Verwendung von in vitro-Systemen, wurden regulierte miRNAs erkannt. In BOECs werden let-7a-5p und let-7c durch Insulin reguliert. MiR-106a wurde von IFNT in BEND-Zellen kontrolliert. Interessanterweise spielte der MAPK-Signalweg in beiden Fällen eine zentrale Rolle. Zukünftige Studien werden zeigen, welche Rolle miRNAs über den MAPK-Signalweg bei der Regulation der Funktion von Eileiter und Endometrium spielen.